19F核磁共振光谱揭示帕金蛋白(Parkin)激活过程中的复杂构象动态变化

本研究通过19F NMR技术解析全长帕金蛋白(Parkin)在磷酸化泛素(pUb)和E2～Ub结合状态下的构象重排机制，发现其催化结构域(Rcat)释放依赖于E2～Ub结合，为神经退行性疾病治疗靶点开发提供新见解。

　　

帕金森病作为一种常见的神经退行性疾病，其早发型病例中超过100个PRKN基因突变与帕金蛋白(Parkin)功能障碍相关。这个52 kDa的RING-Between-RING (RBR) E3连接酶在维持线粒体健康中扮演关键角色——当线粒体受损时，它与磷酸化激酶PINK1协同启动受损线粒体的清除程序。然而长期以来，科学家们对Parkin从自抑制状态到完全激活状态的构象转变过程缺乏动态认知，尤其对全长蛋白在生理相关复合物中的构象变化知之甚少。

发表在《Journal of Molecular Biology》的这项研究创新性地采用¹⁹F色氨酸标记技术，结合多维核磁共振分析，首次在原子水平捕捉了全长Parkin在激活过程中的构象动态。研究人员通过构建系列Parkin截短体（包括Ubl结构域、R0RBR区域和IBR-Rcat片段），利用位点特异性突变和同位素标记，系统分析了8个色氨酸位点在Parkin-pUb-E2～Ub三元复合物形成过程中的化学位移变化。通过弛豫时间(T₂)测量和化学位移扰动分析，揭示了磷酸化Ubl(pUbl)结构域的动态平衡以及Rcat结构域释放的关键分子机制。

【主要技术方法】

研究采用5-¹⁹F-色氨酸标记技术制备系列Parkin蛋白变体；通过磷酸化反应生成pUb和pUbl；构建UbcH7-Ub异肽复合物模拟E2～Ub共轭物；运用¹⁹F NMR监测化学位移变化；结合T₂弛豫分析评估构象动态；采用热迁移实验验证蛋白稳定性；通过体外泛素化实验验证酶活功能。

【研究结果】

1. 1.

   Proof of Principle: ¹⁹F-Ubl Replicates in Trans Binding and Release

   通过¹⁹F标记的Ubl结构域(W54/W74)证实，pUb结合可诱导Ubl从RING1结构域解离。化学位移分析显示W54在结合态(-123.3 ppm)与游离态(-123.8 ppm)间存在动态平衡，T₂值从游离态的62.8 ms降至结合态的5.8 ms。

2. 2.

   ¹⁹F-Trp Signals are Sensitive Markers for Rcat Association in Parkin

   Rcat结构域色氨酸(W453/W462)在游离IBR-Rcat片段中化学位移显著偏移(-126 ppm)，而在全长Parkin中保持-120.8 ppm，证实Rcat与RING0的稳定相互作用。

3. 3.

   Parkin Activated with pUb shows Bound and Released Ubl Populations

   pUb结合导致Ubl呈现35%结合态与65%游离态的混合构象，W54化学位移(-123.7 ppm)介于两者之间，为PINK1磷酸化S65创造空间条件。

4. 4.

   Fully Activated Parkin shows a Mobile pUbl domain and Retained Rcat Binding to RING0

   磷酸化Parkin(pParkin)中pUbl结构域存在80%结合RING0与20%游离的动态平衡，但Rcat结构域仍保持与RING0结合，W462化学位移变化仅0.1 ppm。

5. 5.

   The Rcat Domain is Released in the Ternary pParkin:pUb:UbcH7-Ub Assembly

   E2～Ub结合导致Rcat结构域完全释放，W462信号消失并出现-126 ppm宽峰，同时pUbl结构域结合比例提升至100%。

【结论与意义】

该研究首次在生理相关复合物尺度解析了Parkin激活的级联构象变化：pUb结合引发Ubl结构域动态释放→磷酸化形成pUbl-RING0弱相互作用→E2～Ub结合最终触发Rcat结构域释放。这一发现修正了既往认为pUbl结合直接导致Rcat释放的模型，揭示E2～Ub结合才是Rcat结构域重排的关键触发因素。

技术层面，研究建立的¹⁹F NMR策略为研究大分子量(>50 kDa)蛋白质动态提供了新范式。医学意义上，Parkin构象变化的精确调控机制为开发针对帕金森病的变构调节药物指明了新方向，特别是针对E2～Ub结合界面的干预可能成为治疗新策略。研究还提示全长蛋白研究的重要性——截短体可能掩盖关键构象依赖性，这为后续神经退行性疾病相关蛋白研究提供了方法学启示。