基于氨甲酰磷酸合成模块的多酶级联系统构建与优化实现高效胍基乙酸生产

本文创新性地构建了以氨甲酰磷酸(CPS)合成模块为核心的多酶级联系统，通过精氨酸再生和副产物循环利用策略，显著提升了胍基乙酸(GAA)的合成效率。研究者采用结构导向的拟南芥精氨酸:甘氨酸脒基转移酶(AGAT)改造获得AtE31K/G351N突变体（活性提升2.5倍），结合代谢流分析优化氨甲酰磷酸限速步骤，最终在双质粒系统(pRSFDuet-1/pETDuet-1)中实现8酶共表达，获得18.35 g/L（156.75 mM）GAA产量，精氨酸摩尔转化率达261.12%。该研究为工业化GAA生产提供了新范式。

　　

Highlight

本研究成功构建了以氨甲酰磷酸(Carbamoyl phosphate, CP)合成为核心的胍基乙酸(GAA)多酶级联生产系统。通过拟南芥来源的精氨酸:甘氨酸脒基转移酶(AGAT)定向进化获得AtE31K/G351N突变体，其酶活提升至7.4 U/mg（野生型2.5倍），使GAA产量从11.1 mM提升至15.2 mM。代谢流分析揭示CP是限速步骤，引入谷氨酰胺合成酶(GS)和氨甲酰激酶(CK)显著增强了CP合成通量。

关键酶筛选与改造

从6种微生物AGAT同源酶中筛选出拟南芥AtAGAT作为模板，通过分子动力学模拟发现31和351位点突变可增强底物结合。突变体AtE31K/G351N的k_cat/K_m值提升3.2倍，分子对接显示其与精氨酸的相互作用能降低2.8 kcal/mol。

代谢网络优化

为解决精氨酸供给瓶颈，构建了包含脲酶(Urease)、鸟氨酸氨甲酰转移酶(OTC)等8种酶的"精氨酸再生循环"。通过双质粒系统在E. coli BL21(DE3)中协调表达，CP通量提升4.3倍，有效避免了鸟氨酸积累。

工艺强化

优化后的60小时生物转化过程达到18.35 g/L GAA（156.75 mM），精氨酸转化率突破261.12%，较前人研究提升2.1倍。该系统展现出工业化应用潜力，并为复杂酶系统的模块化设计提供了普适性策略。

Conclusion

该工作通过酶分子改造、代谢通路优化和模块化组装的三步策略，建立了目前最高效的GAA生物合成平台。特别值得注意的是，CP合成模块的工程化改造实现了精氨酸的高效循环利用，这一设计理念可拓展至其他高附加值氨基酸衍生物的绿色制造。