基于连接依赖性探针扩增技术（LPA）实现8-氧代鸟嘌呤（8-oxo-dG）和无嘌呤位点的链特异性定量分析

为解决氧化性DNA损伤（如8-oxo-dG）在转录和修复过程中高分辨率链特异性检测的难题，研究人员开发了新型连接依赖性探针扩化技术（LPA）。该方法通过酶切、选择性连接和定量PCR，首次实现单核苷酸精度的链特异性分析，揭示雌激素激活的乳腺癌细胞中转录链与非转录链的不对称氧化修复动态，为理解氧化损伤在表观遗传调控中的作用提供了重要工具。

　　

在基因组稳定性研究中，氧化性DNA损伤一直是困扰科学家的难题。其中8-氧代-7,8-二氢鸟嘌呤（8-oxo-dG）作为最常见的诱变损伤，不仅会导致点突变和基因组不稳定，近年还被发现可能作为表观遗传标记参与转录调控。然而，现有检测技术如质谱和免疫荧光无法实现单核苷酸分辨率的链特异性分析，而高通量测序方法又存在覆盖偏差和链特异性信号解析困难等问题。这种技术瓶颈严重限制了对氧化损伤动态及其生物学功能的深入理解。

来自意大利那不勒斯费德里科二世大学的Antonio Pezone团队在《Redox Biology》发表的研究，开发了革命性的连接依赖性探针扩增技术（Ligation-Dependent Probe Amplification, LPA）。这项技术巧妙结合了甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶（FpG）的特异性和热稳定连接酶（Ligase-65）的高效性，通过定量PCR信号差异实现损伤位点的精确定量。研究人员以雌激素刺激的乳腺癌MCF-7细胞为模型，首次捕捉到转录激活过程中DNA两条链的不对称氧化模式——转录链呈现快速修复特征，而非转录链损伤更持久。这些发现为理解氧化损伤在基因调控中的时空特异性作用提供了全新视角。

关键技术方法包括：1）链特异性探针设计与连接系统，利用FpG酶在8-oxo-dG位点产生单核苷酸缺口阻断连接；2）体外合成含不同比例8-oxo-dG的DNA片段验证灵敏度；3）二维超高效液相色谱-串联质谱（2D UPLC-MS/MS）平行验证；4）雌激素刺激时间梯度实验解析损伤修复动力学。

研究结果部分：

1. 1.

   氧化损伤检测原理验证：通过H₂O₂处理证实LPA可定量检测剂量依赖性氧化损伤，免疫荧光显示8-oxo-dG病灶增加与LPA信号降低呈负相关。

2. 2.

   技术特异性验证：体外实验证明LPA对8-oxo-dG的检测限达20%，且不识别5-甲酰胞嘧啶（5fC），凸显其对氧化嘌呤的特异性。

3. 3.

   转录相关氧化特征：在雌激素受体靶基因TFF1的雌激素响应元件（ERE）区域，发现转录链（-链）在5分钟内即出现氧化，15分钟完成修复；而编码链（+链）氧化延迟至15分钟，修复持续30分钟，这种时序差异暗示氧化损伤可能引导转录泡形成方向。

讨论指出，LPA技术的优势在于克服了传统方法在G-四链体（G4）区域的检测盲区，且比纳米孔测序等新技术更经济高效。值得注意的是，FpG酶对多种氧化嘌呤的广谱活性提示LPA信号可能是复合损伤的反映，这需要通过质谱联用进一步解析。该研究不仅提供了研究DNA损伤修复动力学的新工具，更深化了对氧化还原信号调控转录机制的理解——8-oxo-dG可能不仅是损伤副产物，更是基因激活过程中精确调控的"氧化开关"。这些发现为癌症等氧化应激相关疾病的机制研究开辟了新途径。