靶向间皮素低表达实体瘤的DARPin-药物偶联物创新疗法：克服可溶性间皮素干扰并增强免疫治疗协同效应

本研究针对间皮素(MSLN)靶向治疗中可溶性间皮素(sMSLN)干扰疗效的关键难题，开发了特异性结合MSLN蛋白酶敏感C端区域的DARPin(M7)及其药物偶联物(M7A-DC/M7GA-DC)。通过融合白蛋白结合域(ABD)延长半衰期并引入自组装肽G7增强亲和力，该偶联物在MSLN低表达的胰腺癌模型中展现出显著穿透性和旁观者杀伤效应，与PD-1阻断联用可重塑肿瘤微环境并形成长期免疫记忆，为实体瘤治疗提供了新型联合策略。

　　

在精准癌症治疗领域，间皮素(MSLN)因其在间皮瘤、胃癌和胰腺癌等恶性肿瘤中的高表达而成为热门靶点。然而这个"理想靶标"却暗藏玄机——肿瘤细胞分泌的可溶性间皮素(sMSLN)如同"分子烟雾弹"，会中和靶向药物活性，导致现有抗体药物偶联物(ADC)疗效大打折扣。更棘手的是，传统ADC的大分子量限制了其在实体瘤中的穿透能力，而小分子药物又面临半衰期短的困境。面对这些挑战，南京大学医学院附属鼓楼医院团队在《Nature Communications》发表创新成果，开发出能精准识别MSLN"致命弱点"的新型靶向武器。

研究团队运用噬菌体展示技术筛选出特异性结合MSLN膜近端表位的DARPin(M7)，通过融合白蛋白结合域(ABD)延长半衰期，并创新性引入酵母Sup35蛋白衍生的自组装肽(G7)构建了两种奥瑞他汀(MMAE)偶联物：M7A-DC和M7GA-DC。采用表面等离子共振(SPR)分析结合动力学，建立三维肿瘤球体和异种移植模型评估穿透性和疗效，并通过流式细胞术和免疫荧光分析免疫微环境重塑机制。

筛选和表征MSLN特异性DARPin M7

通过三轮噬菌体展示筛选获得高亲和力(KD=7.9×10^-9M)的M7，分子对接模拟证实其特异性结合MSLN的膜近端蛋白酶敏感区(残基487-581)。流式细胞术显示M7能区分MSLN阳性的MKN45/NCI-N87细胞和阴性SW480细胞，免疫荧光验证其在肿瘤组织的特异性富集。

M7A-DC和M7GA-DC的结构与特性

将ABD和G7肽分别融合至M7的N端，SPR检测显示M7GA-DC亲和力(KD=1.5×10^-9M)较M7A-DC提高5倍。通过马来酰亚胺化学构建DAR为4的均一偶联物，质谱验证分子量准确。

体外作用机制解析

偶联物可被MSLN阳性细胞内化至溶酶体，释放MMAE诱导G₂/M期阻滞和凋亡。独特的是，即使存在1000 ng/mL sMSLN，其IC₅₀仍保持稳定。共培养实验证实旁观者效应可杀伤50%邻近MSLN阴性细胞，同时诱发活性氧(ROS)升高和钙网蛋白(CRT)膜暴露等免疫原性细胞死亡(ICD)特征。

突破实体瘤穿透屏障

在三维肿瘤球体模型中，M7GA-DC穿透深度达核心区域，而传统ADC仅分布于边缘。治疗48小时后，M7GA-DC诱导的细胞死亡率(56.7%)显著高于ADC(42.5%)。

体内疗效验证

在MSLN高表达的胃癌模型(MKN45)中，2.5 mg/kg剂量可使肿瘤重量减少96.9%。更引人注目的是，在MSLN低表达的胰腺癌(PANC1)模型仍显示显著生存获益。药代动力学显示ABD融合使半衰期从11.4分钟延长至20.08小时，AUC增加20倍。

免疫协同效应

与PD-1抗体联用使完全缓解率提升至33%，并诱导47.5%的CD80⁺CD86⁺树突细胞活化。记忆T细胞(T_CM)比例在脾脏增加至32.5%，二次攻击实验显示100%肿瘤抑制，证实形成长效免疫记忆。

这项研究开创性地将DARPin的精准靶向性与免疫调节功能相结合：一方面通过靶向MSLN"不可脱落"的膜近端表位破解sMSLN干扰难题，另一方面借助G7自组装模块实现"低表达不放过"的广谱识别。更重要的是，该策略突破了传统ADC的分子量桎梏，为胰腺癌等难治性肿瘤提供了可协同免疫检查点抑制剂的新型治疗范式。从转化医学角度看，这种"靶向杀伤-免疫激活-检查点阻断"的三联模式，或将成为下一代实体瘤联合治疗的标杆方案。