蓝藻中果糖-1,6-二磷酸酶在异养生长和糖原代谢中的特异性功能解析

本研究针对蓝藻Synechocystis中果糖-1,6-二磷酸酶(FBPase)的生理功能谜题，通过生化表征与遗传学分析揭示：区别于双功能F/SBPase在卡尔文循环中的核心作用，单功能FBPase特异性水解FBP而不具SBPase活性，且在氧化条件下保持活性。研究发现Δfbpase突变体在黑暗条件下生长受限且糖原积累增加，表明FBPase通过调控FBP水平影响糖原与中心碳代谢平衡，为理解蓝藻昼夜代谢转换提供了新视角。

　　

在自然界昼夜交替的韵律中，蓝藻作为光合原核生物的代表，需要不断切换其碳代谢模式——白天通过卡尔文-本森-巴沙姆循环(CBB循环)固定CO₂合成糖类，夜间则降解储存的糖原维持生命活动。这种精妙的代谢转换背后隐藏着怎样的分子调控机制？特别是对于控制糖代谢流向的关键酶——果糖-1,6-二磷酸酶(FBPase)，其在蓝藻中的生理功能长期存在认知空白。

传统认知中，蓝藻Synechocystis sp. PCC 6803被认为缺乏典型的糖酵解控制点，因其基因组编码两种特殊的ADP依赖型磷酸果糖激酶(PFK-A1/A2)和一种双功能F/SBPase。然而，该生物还拥有另一个神秘的slr0952基因编码的单功能FBPase，其表达量低且敲除后不影响光下生长，使得学界对其功能充满疑问。这项发表在《Journal of Experimental Botany》的研究，正是要解开这个困扰研究者多年的谜题。

研究人员首先通过重组蛋白表达和纯化获得高纯度FBPase，发现其严格依赖Mg²⁺且特异性水解FBP，对SBP无活性。与受AMP抑制和氧化还原调控的双功能F/SBPase不同，FBPase不受常见代谢物调控。结构分析显示其具有典型I类FBPase折叠，但缺乏植物叶绿体cpFBPase的调控半胱氨酸和AMP结合位点。

为探究生理功能，团队构建了Δfbpase突变体及f/sbpase部分缺失株。酶活测定揭示：在还原条件下（光适应状态），F/SBPase贡献主要FBPase活性；而在氧化条件下（暗适应状态），FBPase活性占比显著提升。生长表型分析显示Δfbpase在黑暗中的异养生长期显受限，同时伴随糖原积累增加，但葡萄糖摄取不受影响。进一步实验表明，两种PFK同工酶在黑暗中协同作用，而转醛缩酶TalB仅参与暗代谢。

关键技术包括：重组蛋白的金属离子亲和层析纯化、连续偶联酶法测定酶活动力学、³¹P NMR验证底物特异性、基于AlphaFold的结构建模与分子对接分析、蓝藻突变体的表型组学分析（生长曲线、糖原含量测定）等。

研究结果部分：

1. 1.

   "Overexpression and purification of the recombinant FBPase"：成功表达纯化出40 kDa的FBPase，SEC证实其天然形式为163 kDa的四聚体。

2. 2.

   "Biochemical characterization of FBPase"：酶学分析显示其V_max为12.7 U mg^-1，K_m(FBP)为0.18 mM，且不受AMP等效应物调控。

3. 3.

   "Monofunctional FBPase lacks SBPase activity"：通过BmFBA合成SBP，证实FBPase不能水解SBP，且DHAP和E4P不影响其FBPase活性。

4. 4.

   "Structural comparison"：结构比对发现Synechocystis FBPase与植物cpFBPaseII更相似，均缺乏氧化还原调控域。

5. 5.

   "Phylogenetic relation"：系统发育分析表明蓝藻FBPase与所有植物FBPase/SBPase的亲缘关系比其自身F/SBPase更近。

6. 6.

   "In vivo FBPase activity"：细胞粗提物酶活测定显示FBPase在氧化条件下贡献约30%总活性。

7. 7.

   "Growth of deletion mutants"：Δfbpase在黑暗中出现生长缺陷（OD₇₅₀降低约20%）和糖原积累现象。

8. 8.

   "Heterotrophic glucose consumption"：突变体葡萄糖摄取正常但糖原含量增加30-50%，提示代谢流向改变。

讨论部分指出，FBPase与PFK-A可能形成"底物循环"精细调控糖酵解通量，同时通过控制FBP水平影响磷酸葡萄糖变位酶(PGM1)活性，从而调节糖原与中心碳代谢的平衡。这一发现不仅阐明了蓝藻昼夜代谢转换的新机制，也为理解植物中同源酶的功能进化提供了线索。特别是植物叶绿体中存在的非氧化还原敏感型cpFBPaseII，可能执行类似黑暗代谢调控的功能。该研究为改造蓝藻碳代谢提高生物技术应用潜力提供了理论依据。