三维细胞片层模型显著提升可降解镁基材料成骨潜能的体外预测准确性

为解决传统二维(2D)单层细胞模型评估可降解镁基金属(Mg-based metals)时出现的体内外结果不一致问题，研究人员创新性构建了三维(3D)BMSC细胞片层模型。通过层叠组装技术证实该模型能显著提升细胞间相互作用蛋白(N-Cadherin/Vinculin)表达，增强对镁降解产物的耐受性，并准确反映体内成骨基因(BMP2R/RUNX2/SP7)表达模式。研究为加速镁基生物材料的临床转化提供了更可靠的体外评估平台。

　　

在骨科和口腔种植领域，可降解镁基金属因其独特的生物相容性和促骨再生能力备受关注。然而这类材料在临床应用时面临一个尴尬矛盾：传统体外评估按照ISO10993-5标准进行的单层细胞实验总是显示严重细胞毒性，与动物实验中观察到的优异成骨效果大相径庭。这种"体外说有毒，体内却有效"的怪象，严重阻碍了镁基材料的研发进程。问题根源在于现行评估体系——二维单层细胞培养缺乏真实组织中的三维微环境，无法模拟体内细胞通过紧密连接形成的抗应激能力。更棘手的是，现有方法既不能准确预测材料性能，也难以研究其成骨机制，迫使研究人员过度依赖周期长、成本高且涉及伦理问题的动物实验。

为破解这一困局，来自北京大学口腔医院的研究团队在《Bioactive Materials》发表创新成果。研究团队另辟蹊径，采用温度响应性培养表面构建了具有稳定三维结构的人骨髓间充质干细胞(BMSC)片层模型。通过系统比较单层细胞、细胞片层和体内股骨植入模型的基因表达谱，结合材料学表征和功能实验，揭示了三维细胞组织结构对镁基材料生物相容性评估的关键影响。

关键技术方法包括：1）采用温度响应培养皿通过层叠组装技术构建1-3层BMSC细胞片；2）建立体外骨缺损模型模拟体内修复过程；3）通过慢病毒介导的shRNA敲低N-Cadherin验证其功能；4）采用流式细胞术检测Ki67/ROS/凋亡等细胞应激指标；5）通过RNA-seq和qRT-PCR分析成骨相关基因表达；6）建立小鼠颅骨缺损模型评估4N/5N纯镁及ZE21B/WE43镁合金的成骨效果。

细胞片层展示三维结构及更强成骨能力

通过层叠组装技术成功构建1-3层细胞片，组织学分析显示三层结构厚度达81.5±10.7μm，是单层的3.7倍。Masson染色和免疫荧光证实三层结构富含纤维连接蛋白(Fibronectin)和I型胶原(Collagen I)，关键黏附蛋白N-钙黏蛋白(N-Cadherin)和纽蛋白(Vinculin)表达显著增强。茜素红染色(ARS)显示三层结构在第2天即形成大量矿化结节，成骨基因RUNX2和OCN蛋白表达量分别是单层细胞的5倍和3倍。

细胞片层具有更强毒性抵抗能力

与4N纯镁共培养时，单层细胞出现ROS水平升高2.2倍、凋亡率增加7倍，而细胞片层仅轻微变化。流式检测显示细胞片在50mM Mg²⁺浓度下仍保持活力，而单层细胞在20mM即出现明显毒性。通过控制细胞数量实验证实，这种保护作用源于三维结构而非单纯细胞密度。

N-Cadherin介导细胞片保护机制

敲低N-Cadherin使细胞片的Ki67阳性率从75.7%降至46.1%，ROS水平和凋亡率显著升高。但值得注意的是，敲低组的保护效果仍优于单层细胞，提示细胞片结构本身也提供屏障作用。不同细胞密度对比实验进一步证实，仅增加密度无法复制细胞片的保护效果。

细胞片模型准确反映体内成骨模式

RNA-seq分析显示：在体内模型中，镁植入上调BMPR2/RUNX2/SP7等成骨基因；单层细胞模型却出现这些基因的下调；而细胞片模型完美复现了体内表达模式。GO/KEGG分析揭示细胞片显著富集Hippo和TGF-β等干细胞多能性相关通路。

镁基材料体内外评估验证模型可靠性

小鼠颅骨缺损实验显示：5N纯镁(降解最慢)在第3个月修复92%缺损，显著优于ZE21B(修复63%)和4N纯镁(仅修复29%)。体外细胞片缺损模型中，5N纯镁、ZE21B和WE43均促进缺损修复，与体内结果一致；而单层模型却错误显示WE43抑制修复。

这项研究突破性地建立了可降解金属的三维评估新范式。细胞片层模型通过N-Cadherin介导的细胞间连接和ECM屏障作用，有效抵抗镁降解产物的毒性，并准确捕捉到镁离子对成骨分化的促进作用。特别值得注意的是，该模型成功解释了临床观察中的"体外毒性-体内有效"矛盾现象——传统单层细胞因缺乏组织结构的保护而过早暴露于毒性浓度，而三维结构通过细胞间信号网络和物理屏障实现了对微环境的缓冲调节。

研究还揭示了材料纯度的重要性：5N高纯镁因减少微电偶腐蚀展现出最佳成骨性能，这为医用镁合金的原料选择提供了直接依据。所建立的体外缺损模型可同步评估材料降解与组织再生过程的匹配性，为研究"降解-再生"动态平衡提供了新工具。从转化医学角度看，这种三维评估体系将大幅降低研发成本，加速可降解金属的临床转化，并为其他动态降解材料的生物相容性评估提供方法论参考。