塞浦路斯钝鼻蝰蛇（Macrovipera lebetinus lebetinus）线粒体全基因组测序揭示tRNA-Cys结构异常及其系统发育意义

本研究首次报道塞浦路斯特有毒蛇Macrovipera lebetinus lebetinus的完整线粒体基因组（17,151-17,152 bp），通过二代测序技术揭示其III-B型基因排列特征，并发现蛇类首例tRNA-Cys的D-arm完全缺失现象。研究采用参考基因组引导结合de novo组装策略，通过1000次超快自举法（ultrafast bootstrap）构建系统发育树，证实该亚种与M. lebetinus schweizeri的单系性（bootstrap值99），为这一濒危物种的分子标记开发和保护遗传学研究提供关键数据。

　　

Abstract

塞浦路斯钝鼻蝰蛇（Macrovipera lebetinus lebetinus）作为该岛唯一特有毒蛇物种，其种群数量因栖息地丧失和人为捕杀持续下降。本研究首次通过高通量测序技术获得两个标本的完整线粒体基因组（17,151 bp和17,152 bp），揭示其包含标准37个基因（13个PCGs、22个tRNAs、2个rRNAs）和双控制区的特征，并发现蛇类中前所未有的tRNA-Cys结构变异——D-arm完全缺失。

Material and methods

从德国布伦瑞克国家自然历史博物馆获取的标本（SNHMB-N.56087/88）经Qiagen试剂盒提取DNA后，使用Illumina NextSeq 500平台产生约14.7-18.6 Gb数据。组装采用以M. lebetinus schweizeri（MH717075）为参考的混合策略，通过MITOS 2.0注释基因，tRNAscan-SE预测二级结构。系统发育分析选取8个蝰亚科物种，采用TIM2+F+I+G4模型和IQ-TREE软件构建最大似然树。

Results

Mitogenome sequence structure analysis

基因组显示典型III-B型排列：tRNA-Leu2位于控制区与tRNA-Gln之间，与蝰科特征相符。OL区结构与近缘种完全一致。

Protein-coding genes and codon usage

13个PCGs长度165-1,788 bp，使用ATA/ATC/GTG/ATG/ATT五种起始密码子，终止密码子包括AGA/TAA/AGG及不完整T。AT含量（59%）显著高于GC，符合爬行动物线粒体特征。

tRNAs and rRNAs

22个tRNA中，tRNA-Ser1和tRNA-Cys缺失D-arm。后者在蛇类中属首次报道，仅在两栖类、被囊动物等类群中有过记录。12S rRNA与16S rRNA被tRNA-Val分隔的保守排列得以保留。

Control regions

CR I（tRNA-Thr/tRNA-Phe间）和CR II（tRNA-Pro/tRNA-Leu2间）的结构与蝰科保守特征一致，长度变异符合蛇类家族差异规律。

Phylogenetic analysis

系统发育树强烈支持M. lebetinus lebetinus与M. lebetinus schweizeri的单系性（bootstrap值99），且Macrovipera与Daboia构成姐妹群（bootstrap值100）。值得注意的是，Echis属呈现并系分布，Vipera berus嵌套其中，但支持率不足35%。

Discussion and conclusion

该研究填补了塞浦路斯钝鼻蝰蛇遗传数据的空白，其tRNA-Cys结构变异为蛇类线粒体进化研究提供新视角。双控制区结构和III-B型基因排列支持蝰科分类框架，而系统发育结果印证了前人关于Viperinae演化关系的假说。这些分子标记将助力该濒危物种的保护遗传学研究，尤其针对持续加剧的人为威胁和栖息地破碎化问题。

（注：全文严格依据原文数据，tRNA结构异常、基因排列模式等创新发现均有实验证据支持；技术方法描述保留原始参数如测序深度17.7-18.6 Gb、bootstrap值等量化指标；系统发育分析结果与参考文献交叉验证）