由非血红素铁双加氧酶Dapdiamide生物合成酶C催化的底物环氧化反应。为什么底物会被固定（即与酶结合）呢？

《Chemistry – A European Journal》：Substrate Epoxidation Catalyzed by the Nonheme Iron Dioxygenase Dapdiamide Biosynthesis Enzyme C. Why Is the Substrate Tethered?

非血红素铁酶DdaC通过蛋白载体将底物固定在活性位点，分子动力学模拟显示tethered底物与酶蛋白形成更多氢键，金属中心距离更近，量子化学计算表明其环氧化反应能垒比nontethered底物低7 kcal/mol，证实载体蛋白优化催化效率。

　　本研究通过计算模拟的方式，探讨了非血红素铁氧酶DdaC在催化双键环氧化反应过程中，是否利用载体蛋白与底物之间的连接对反应机制产生影响。非血红素铁氧酶是一类在自然界中广泛存在的酶，它们参与了许多天然产物的合成过程。这些天然产物对于生物体的正常运作和防御机制至关重要。某些非血红素铁氧酶能够以特定的方式对底物进行选择性反应，从而生成具有高产率的结构独特的天然产物。因此，理解这些反应的机制不仅有助于揭示生物催化过程的原理，还可能为生物技术中合成有价值的材料提供理论支持，尤其是在药物开发等领域。

在特定的抗生素生物合成过程中，存在一个关键的步骤，即由酶DdaC催化的双键环氧化反应。有趣的是，DdaC的前体酶DdaD通过硫酯键将底物Nβ-富马酰非蛋白质生成的氨基酸2,3-二氨基丙酸（NβFmmDAP）连接到一个载体蛋白上。这种由载体蛋白锁定的底物在反应过程中可能具有特定的优势。然而，实验研究未能明确产物的立体化学结构，且尚不清楚为何需要将底物与载体蛋白连接，以及自由底物是否能够形成相同的产物。为了进一步理解这种连接对环氧化反应的影响，本研究采用两种模型进行计算模拟：一种是底物与载体蛋白连接的模型，另一种是底物自由存在的模型。

通过分子动力学（MD）模拟，研究人员发现载体蛋白对底物在活性位点的定位和反应过程具有重要影响。在MD模拟过程中，两种模型都表现出快速的平衡状态，表明酶结构在模拟过程中保持了较高的稳定性。在载体蛋白存在的情况下，底物与酶的结合更为紧密，并形成了更强的氢键相互作用，特别是与Gln224、Asn107和Thr93等关键氨基酸残基的相互作用。这些相互作用有助于将底物固定在活性位点的特定位置，使其更接近金属中心，从而促进环氧化反应的进行。相比之下，自由底物在活性位点的定位较为动态，缺乏稳定的氢键作用，导致其在催化过程中可能无法达到最佳反应条件。

为了进一步分析底物与酶之间的相互作用，研究人员利用了MD模拟的平均结构，比较了两种模型的底物结合方式和位置。结果表明，与载体蛋白连接的底物在活性位点的定位更为理想，能够更有效地接近金属中心。而在自由底物模型中，底物的位置变化较大，可能影响其与金属中心的相互作用，进而影响反应效率。此外，研究还发现，载体蛋白的存在可能会改变酶的折叠方式，从而影响活性位点的结构和大小，为底物提供更合适的反应环境。

为了更深入地研究底物的激活机制，研究人员构建了两种量子化学（QM）模型，分别代表连接和自由底物的情况。这些模型包含了金属中心及其第一和第二配位球的结构。通过量子化学计算，研究人员发现连接底物的环氧化反应势垒显著低于自由底物。在连接底物模型中，反应的自由能变化仅为12.0 kcal mol?1，而在自由底物模型中，这一值达到了19.9 kcal mol?1。这表明，载体蛋白对底物的定位和稳定作用有助于降低反应势垒，提高反应效率。

进一步分析过渡态结构时，研究人员发现连接底物模型中的过渡态具有更大的负静电势，而自由底物模型则表现出较高的正静电势。这种静电势的差异对反应的能垒产生了重要影响，连接底物的环氧化反应更容易进行。此外，连接底物模型中的反应路径表现出更强的电子转移特性，这可能有助于形成稳定的中间体，从而促进环氧化反应的完成。

研究还表明，连接底物模型中的反应过程具有显著的立体选择性，能够形成特定的顺式环氧化产物。这可能与底物在活性位点的定位和氢键相互作用有关。相比之下，自由底物模型的反应路径则缺乏这种立体选择性，可能形成不同的产物结构。这些发现对于理解非血红素铁氧酶如何通过底物连接机制实现高效的催化反应具有重要意义。

此外，研究还揭示了底物与酶之间的相互作用如何影响反应的电子结构和能量分布。在连接底物模型中，金属中心与底物之间的相互作用更为稳定，这有助于降低反应的能垒。而在自由底物模型中，由于缺乏这种稳定的相互作用，反应过程可能更加困难。这些结果表明，底物连接机制在非血红素铁氧酶的催化反应中起着至关重要的作用。

本研究通过计算模拟的方式，揭示了载体蛋白对底物定位和反应机制的影响。这些发现不仅有助于理解DdaC酶的催化过程，还可能为其他利用底物连接机制的酶提供理论支持。此外，本研究还强调了在生物催化过程中，酶与底物之间的相互作用对反应效率和产物选择性的关键作用。这些结果为未来的生物技术应用提供了重要的理论依据，并可能推动新型催化剂的设计和开发。