冷冻纤维组织高质量细胞核分离新方法：DFGC技术在单核多组学测序中的应用

本文推荐一种创新的细胞核分离技术——匀浆过滤梯度离心法(DFGC)，该方法针对冷冻保存的纤维组织（如心脏）开发，仅需1.5小时即可完成，显著提升单核多组学测序(snMultiome-seq)中snRNA-seq和snATAC-seq数据质量。相比传统微珠分选和流式细胞术(FACS)，DFGC能有效解决大直径细胞(>40?μm)导致的微流控腔堵塞问题，为心脏等复杂组织的单核研究提供突破性解决方案。

　　

亮点

我们开发了匀浆过滤梯度离心法(DFGC)，这是一种从冷冻纤维组织（如心脏）中快速分离高质量细胞核的简易方案。该方法通过优化IGEPAL? CA-630化学裂解与机械匀浆的组合，结合多级过滤(100-10?μm)和碘克沙醇/蔗糖密度梯度离心(25%-35%)，成功克服了传统方法对大型心肌细胞(CMs)的分离瓶颈。

生物材料

实验使用C57BL/6?N小鼠心脏组织，所有操作均符合美国希望之城国家医疗中心动物伦理委员会(IACUC)规范。原始测序数据已提交至NCBI GEO数据库。

冷冻心脏组织的文库构建

DFGC技术流程包含四个关键步骤：冰上组织 minced（1分钟）、预冷匀浆器机械破碎（3分钟）、多级细胞筛过滤（20分钟）和密度梯度离心（40分钟）。该方法显著降低线粒体污染，使直径>40?μm的杆状心肌细胞核能顺利通过10?μm滤膜，满足单核多组学测序的进样要求。

讨论

本研究突破性地解决了成人心脏组织单核测序的核心难题——大型心肌细胞核的分离效率问题。DFGC技术产生的数据质量优于传统微珠分选和流式分选(FACS)，其创新性体现在：1）保留染色质开放状态；2）维持核膜完整性；3）减少^mtDNA污染。该方案为纤维化疾病、心脏发育和再生医学研究提供了重要技术支撑。

生成式AI使用声明

本文写作过程未使用AI生成内容（仅用于语法校对）。

作者贡献声明

王寅：研究设计、实验操作、论文撰写；任迪：数据分析、图表制作；康 Randy：生物信息学分析；张凯：方法优化；彭云倩：动物实验；周 Heather：文献综述；卢葛明：可视化处理；郭俊杰：技术指导；其余作者参与结果讨论与经费支持。

利益冲突声明

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究受美国国立卫生研究院(NIH R01-HL171309/DK126975)和美国心脏协会(AHA 24SCEFIA1255574等)资助，王寅获加州再生医学研究所(CIRM EDU4-12772)博士后奖学金支持。