MARQO流水线：多参数细胞空间分析技术革新癌症组织病变研究

研究人员针对多重免疫染色分析流程碎片化、效率低下的问题，开发了开源自动化流水线MARQO，整合弹性图像配准、迭代核分割、无监督聚类和用户引导分类功能，实现了全玻片单细胞分辨率分析。该技术成功验证了肝细胞癌(HCC)患者对cemiplimab(抗PD1抗体)治疗的CD8+ T细胞富集机制，为肿瘤免疫治疗响应预测提供了重要工具。

　　

在肿瘤免疫治疗时代，理解肿瘤微环境(TME)中免疫细胞的空间分布和相互作用至关重要。然而，多重免疫染色技术虽能同时检测数十种蛋白标记，其数据分析却面临三大挑战：不同平台数据难以整合、全玻片分析计算资源需求大、现有工具依赖人工复核且效率低下。这严重阻碍了从复杂空间生物学数据中挖掘临床相关生物标志物的进程。

《Nature Biomedical Engineering》最新发表的这项研究给出了突破性解决方案。由Mount Sinai医学院团队开发的MARQO(Multiplex-imaging Analysis, Registration, Quantification and Overlaying)流水线，首次实现从图像配准到细胞分类的全流程自动化分析。该技术通过创新性地利用多重免疫组化连续单玻片染色(MICSSS)的迭代核染色特征，开发出"复合分割"算法，将核分割准确率提升至与病理学家手动标注83%的一致性。更引人注目的是，研究者将该技术应用于抗PD1治疗肝细胞癌的II期临床试验(NCT03916627)样本，首次揭示治疗响应者纤维化和坏死区域中CD8⁺ T细胞的空间聚集特征，为免疫治疗响应预测提供了新视角。

关键技术方法包括：1)基于SimpleElastix的弹性图像配准模块处理MICSSS迭代染色数据；2)整合StarDist和CellPose的复合核分割算法；3)采用mini-batch k-means无监督聚类结合用户交互式分类的混合分析策略；4)分布式计算架构实现全玻片快速分析。临床样本来自18例接受新辅助cemiplimab治疗的HCC患者术前活检和术后切除组织。

【MARQO enables analysis of diverse imaging technologies】

研究团队验证了MARQO对MICSSS、多重免疫荧光(mIF)和单重免疫组化(IHC)的兼容性。通过将组织分割为1000×1000像素的瓦片并行处理，该技术成功克服了全玻片分析的内存限制。其中MICSSS数据特有的迭代核染色被转化为优势——通过配准多轮核信号生成复合分割掩模，显著提升细胞边界识别精度。

【Improved segmentation via iterative cell staining】

在10个500μm×500μm区域的头对头比较中，MARQO的复合分割在90%区域达到与人工计数±20%的误差范围。针对红细胞(rBC)干扰开发的过滤算法，经病理学家验证可准确识别92%的红细胞(Supplementary Fig. 3a-c)。这种创新方法解决了高密度区域细胞分割的世界性难题。

【Fast unsupervised clustering improves cell classification】

研究采用两阶段分类策略：先通过mini-batch k-means将细胞分为预设集群，再由用户通过GUI交互确认阳性群。在34个测试区域中，对CD3(T细胞)和FOXP3(Treg细胞)的分类准确率分别达83%和90%，显著优于传统阈值法。这种"机器初筛+专家复核"的模式为数字病理提供了可靠范式。

【Diverse tissue sizes and types are processed using MARQO】

从1mm组织微阵列(TMA)到全玻片切除标本，MARQO在不同尺寸样本中保持稳定性能。对9种癌症类型(包括非小细胞肺癌、三阴性乳腺癌等)的分析显示，CD3和PanCK的检测结果与人工计数高度相关(r=0.98和0.90)，证明其广谱适用性。

【MARQO integrates workflow for multiple staining technologies】

在单重IHC验证中，PD-L1检测结果与常规分析完全一致(P=0.0167)。对COMET mIF平台数据的分析显示，四种标志物(FOXP3、CD3等)的整体相关性达r=0.92，证实其在非IHC平台上的准确性。

【MARQO detects CD8 T cell enrichment in therapy responders】

最具临床价值的发现来自对cemiplimab治疗HCC的时空分析。MARQO不仅确认响应者基线时即存在CD8⁺ T细胞富集(P=0.008)，更首次精确定位这些细胞在治疗后纤维化(P=0.0162)和坏死(P=0.0267)区域的空间聚集。邻近分析显示CD8⁺ T细胞与B细胞、Treg细胞的平均间距小于50μm，提示三级淋巴样结构可能参与治疗响应。

讨论部分强调，MARQO的创新性在于将计算生物学与临床病理需求完美结合：一方面通过分布式计算解决大数据挑战，另一方面保留病理学家在关键决策中的主导地位。虽然当前版本尚不能量化信号强度或识别膜特异性标记，但其模块化设计为后续升级预留空间。这项研究不仅提供了首个MICSSS专用分析方案，更重要的是建立了空间免疫分析的新标准——在肝细胞癌中的发现证实了该技术在揭示免疫治疗机制方面的独特价值。随着肿瘤免疫治疗进入精准时代，MARQO有望成为连接多维组学数据与临床决策的关键桥梁。