靶向CAR-T细胞的CD19/IL-12修饰胞外囊泡递送系统增强抗肿瘤功能研究

本研究针对CAR-T细胞疗法中T细胞持久性不足和抗肿瘤活性受限的问题，创新性地开发了基于CAR靶标修饰的胞外囊泡(EVs)递送系统。研究人员通过构建表面展示CD19和IL-12的EVs(CD19/IL-12 EVs)，实现了细胞因子对CAR-T细胞的靶向递送，显著增强了CAR-T细胞的IFN-γ分泌、细胞毒性和体内扩增能力，同时避免了IL-12的系统毒性，为改善CAR-T细胞功能提供了安全有效的新策略。

　　

在癌症免疫治疗领域，嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法已在B细胞恶性肿瘤治疗中取得显著成功，但超过半数患者仍无法获得长期缓解。究其原因，主要受限于T细胞体内增殖不足、抗肿瘤活性弱、持久性差以及免疫抑制性肿瘤微环境(TME)等因素。白细胞介素12(IL-12)虽能显著增强CAR-T细胞功能，但其临床应用却因全身暴露导致的严重毒性而受限。如何实现IL-12的精准递送，成为提升CAR-T疗效的关键科学问题。

针对这一挑战，Yuanyuan Zhang和Meijuan Huang等研究者创新性地将目光投向天然纳米载体——胞外囊泡(EVs)。这些由细胞分泌的膜泡结构不仅具有优异的生物相容性，还能通过表面修饰实现靶向递送。研究团队设想：能否利用CAR靶标修饰的EVs作为"特洛伊木马"，将IL-12精准送达CAR-T细胞？这一思路促成了发表在《Experimental Hematology》上的重要研究。

研究主要采用以下关键技术方法：1)通过慢病毒转染构建稳定表达膜锚定IL-12和CD19的HEK293T细胞系；2)超速离心法分离纯化不同修饰的EVs(CD19 EVs、IL-12 EVs和CD19/IL-12 EVs)；3)流式细胞术和成像流式分析EVs与CAR-T细胞的结合特性；4)体外共培养实验评估EVs对CAR-T细胞功能的影响；5)建立Raji淋巴瘤小鼠模型进行体内疗效评价；6)RNA测序分析CAR-T细胞的转录组变化。研究使用的CAR-T细胞来自健康供体外周血单个核细胞(PBMCs)。

研究结果部分，各小标题下的主要发现如下：

"Manufacturing of EVs with functional, surface-displayed IL-12"证实成功构建了表面展示IL-12的EVs，其IL-12浓度达1887 pg/mL，且稳定性良好。与重组人IL-12(rhIL-12)相比，IL-12 EVs激活T细胞的EC₅₀值更低(9.4 vs 54.9 pg/mL)，显示更强的生物活性。

"IL-12 EVs enhance the function of CAR-T cells and NK cells"发现IL-12 EVs能显著促进STAT4磷酸化，使CAR-T细胞的IFN-γ和TNF-α分泌增加2-3倍，细胞毒性提升40%，并诱导中央记忆T细胞(T_CM)比例升高。值得注意的是，IL-12 EVs也能激活自然杀伤(NK)细胞，提示需要精准递送策略。

"Targeted delivery of cytokines to enhance CAR-T cell function"部分创新性地构建了共表达CD19和IL-12的EVs。流式分析显示CD19/IL-12 EVs与抗CD19 CAR-T细胞的结合效率比单独IL-12 EVs提高3倍，且这种结合具有CAR特异性。体外实验证明CD19/IL-12 EVs能更有效地增强CAR-T细胞功能，这一策略也成功拓展至CD22 CAR-T细胞和IL-2细胞因子。

"CD19/IL-12 EVs increase CAR-T-cell proliferation and antitumor activity in vivo"通过小鼠模型证实，瘤内注射CD19/IL-12 EVs使CAR-T细胞扩增增加5倍，肿瘤体积缩小70%，且未引起肝肾功能异常或细胞因子风暴等全身毒性，血清IL-6仅轻微升高。

"Transcriptomic analyses of CAR-T cells treated with IL-12 EVs and CD19/IL-12 EVs"通过RNA测序发现，CD19/IL-12 EVs显著激活了JAK/STAT等信号通路，并鉴定出16个IL-12调控的关键基因(如IFNG、IL12RB2等)。这些基因在临床应答良好的慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者CAR-T产品中高表达，可能成为疗效预测标志物。

研究结论与讨论部分强调，该工作首次证明CAR靶标修饰的EVs可作为细胞因子的靶向递送系统，通过以下机制增强CAR-T细胞功能：1)CD19介导的特异性结合提高IL-12递送效率；2)膜锚定IL-12的固相呈现增强信号激活；3)诱导记忆性T细胞表型延长持久性；4)局部递送避免全身毒性。与现有技术相比，这种模块化设计可灵活适配不同CAR靶点和细胞因子组合，如CD22/IL-12或CD19/IL-2等。

这项研究为克服CAR-T细胞治疗瓶颈提供了创新解决方案，其重要意义在于：1)建立了可推广的EVs工程化改造平台；2)证实了靶向递送对减少细胞因子毒性的价值；3)揭示了IL-12调控CAR-T功能的新机制；4)为实体瘤CAR-T治疗提供了新思路。未来研究可进一步优化EVs的靶向性，如引入CD47"别吃我"信号延长循环时间，或开发逻辑门控系统提高特异性，推动这一技术向临床应用转化。