谷氨酸转运体从钠离子偶联到质子偶联的进化机制解析：基于祖先蛋白重建的能量景观重塑研究

本研究通过系统发育分析和祖先蛋白重建（APR），揭示了原核生物谷氨酸转运体从Na+偶联向H+偶联转变的分子机制。研究发现，进化中间体Ancalt通过变构突变使转运体自发形成高亲和力构象，无需Na+结合即可完成底物转运，阐明了离子偶联的“能量景观调控”新范式。该成果发表于《Nature Structural & Molecular Biology》，为理解膜转运蛋白功能进化及药物设计提供了新视角。

　　

细胞膜上的转运蛋白如同精密分子机器，利用离子梯度能量驱动营养物质跨膜运输。谷氨酸转运体家族（SLC1）在从古菌到人类的进化长河中，发展出Na⁺偶联（如人源EAATs）和H⁺偶联（如细菌Glt_Tk）两种机制，但二者转换的进化路径始终成谜。更令人困惑的是，某些环境（如淡水、发酵食品）中Na⁺稀缺，却仍存在既不依赖Na⁺也不依赖H⁺的“离子非偶联”转运体——它们如何突破能量耦合的物理限制？

为破解这一难题，Krishna D. Reddy和Olga Boudker团队创新性地将系统发育分析与祖先蛋白重建（APR）技术结合，重构出关键进化节点上的古菌转运体。研究聚焦于三个关键祖先蛋白：Na⁺偶联的Anc^Na、过渡态Anc^alt和H⁺偶联的Anc^H。通过冷冻电镜（cryo-EM）解析结构发现，Anc^alt的转运域（transport domain）中，TM7螺旋上的两个关键突变（P295₂₇₃S/Q327₃₀₅N）通过变构效应重塑了能量景观：使低亲和力构象（需Na⁺稳定）与高亲和力构象（自发形成）的能量差消失，从而实现了Na⁺非依赖的底物结合。

研究主要采用四大技术手段：1）基于1,153个原核生物序列的最大似然法（ML）系统发育分析；2）祖先序列重建与分子进化模拟；3）纳米圆盘（nanodisc）重组结合冷冻电镜解析转运体构象；4）显微热泳动（MST）和放射性标记转运实验验证功能。

关键结果

1. 1.

   进化中间体的离子非偶联特性

   通过放射性标记实验发现，Anc^alt在无Na⁺条件下仍能高效转运L-天冬氨酸（L-aspartate），其结合亲和力（K_D≈30 μM）与Na⁺存在时相当。

2. 2.

   自发形成的高亲和力构象

   冷冻电镜结构显示，Anc^alt在无配体时即存在两种构象：一类与传统Na⁺偶联转运体的低亲和力状态类似（NMD环“外翻”）；另一类则罕见地呈现高亲和力状态（NMD环“内翻”），其底物结合位点架构与Na⁺结合后的Glt_Ph完全一致。

3. 3.

   保留完整的Na⁺结合位点

   尽管Anc^alt无需Na⁺即可工作，其三个Na⁺结合位点（Na1-Na3）的结构却完好保留，仅通过水分子的占位补偿缺失的离子。

4. 4.

   变构突变的决定性作用

   将Anc^alt的S295₂₇₃和Q327₃₀₅逆向突变为祖先状态后，Na⁺偶联功能完全恢复，证实这两个位点通过调控TM7螺旋的刚性，决定构象平衡。

研究意义

这项工作首次揭示膜转运蛋白功能进化的“能量景观调控”机制：离子偶联的丢失并非通过逐步破坏结合位点，而是先经变构突变降低高亲和力状态的能垒。这种进化策略既避免功能中断，又为后续结合位点的退化赢得时间。该发现不仅解释了自然界中离子偶联多样性的起源，更为设计“部分去偶联”药物提供了新思路——通过变构调节而非直接抑制，可精细调控转运体的浓缩能力，减少完全阻断带来的副作用。

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