新型高通量生化竞争检测技术开发用于人脱唾液酸糖蛋白受体1配体筛选

为解决ASGPR配体筛选缺乏高通量检测方法的瓶颈，AstraZeneca团队开发了基于重组人三聚体ASGR1蛋白的TR-FRET和FP竞争结合检测技术。该研究建立了384/1536孔板检测体系，检测范围达2.5 nM-100 μM，通过7500化合物库筛选获得5个新型配体，为肝靶向药物递送系统开发提供了新工具。

　　

肝脏作为人体重要代谢器官，其特异性药物递送一直是生物医药领域的重大挑战。脱唾液酸糖蛋白受体(Asialoglycoprotein Receptor, ASGPR)因其在肝细胞表面的高密度表达和快速内化特性，成为肝靶向递送的"黄金靶点"。尽管天然配体N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)已成功应用于寡核苷酸药物的肝靶向递送，但现有配体发现方法受限于放射性标记、低通量等技术瓶颈，严重制约了新配体的开发进程。

针对这一关键问题，来自AstraZeneca的Jianming Liu团队在《SLAS Discovery》发表了创新性研究成果。研究人员采用重组人三聚体ASGR1蛋白和Alexa-647标记的三价GalNAc探针，开发了两种新型生化竞争结合检测技术。通过时间分辨荧光能量转移(TR-FRET)和荧光偏振(FP)检测原理，建立了覆盖2.5 nM-100 μM检测范围的384/1536孔板高通量筛选平台。

关键技术方法包括：1）利用胶原XV的NC1三聚化结构域构建重组人三聚体ASGR1蛋白；2）优化建立TR-FRET和FP检测体系；3）采用1536孔板对7500化合物库进行高通量筛选；4）通过表面等离子共振(SPR)和分子对接验证活性化合物。

研究结果部分：

3.1. 重组人三聚体ASGR1蛋白设计

通过融合胶原XV的NC1三聚化结构域，成功构建了分子量约140 kDa的糖基化三聚体ASGR1。SEC-MALS和质谱光散射分析证实其三聚体形态，热稳定性实验显示GalNAc结合可使蛋白熔解温度提高8°C。

3.2. ASGR1 TR-FRET检测开发

优化后的检测体系包含20 nM三聚体ASGR1、10 nM (GalNAc)₃-Alexa647探针和0.2 μg/mL Tb-抗His抗体。该体系可区分单价/三价配体，如三价Compound 6的IC₅₀达1 nM，较单价形式活性提高5000倍。

3.3. ASGR1 FP检测微型化

将检测体系微型化至6 μL 1536孔板格式，Z'因子>0.5。探针K_d值为24.1 nM，与TR-FRET检测结果高度一致(r²=0.89)。

3.5. 苗头化合物发现

筛选7500化合物获得23个活性分子(IC₅₀ 12-100 μM)，其中5个经SPR验证。Hit 3(IC₅₀=78.1 μM)与已报道的ASGPR配体鸟苷结构相似，分子对接显示其核糖部分以C3'-endo构象结合Ca²⁺位点。

这项研究的重要意义在于：首次建立了基于重组人三聚体ASGR1的高通量筛选平台，突破了传统检测方法在通量和安全性方面的限制。发现的非GalNAc结构新型配体，为开发肝靶向递送系统提供了更多化学空间。特别值得注意的是，该技术可应用于小分子药物、LYTACs(溶酶体靶向嵌合体)等多种形式的肝靶向治疗开发，具有广阔的转化应用前景。研究团队指出，未来可通过结构优化提高配体亲和力，并探索其在siRNA等治疗分子递送中的应用效能。