酶工程与群体感应系统联用实现大肠杆菌高效合成β-熊果苷

为解决β-熊果苷(β-arbutin)微生物合成中碳通量分布不均、糖苷合成酶催化效率低及外源诱导剂成本高的问题，研究人员通过酶工程改造arbutin synthase(AS)活性位点通道获得R241H突变体，结合luxR群体感应(QS)系统实现自诱导调控，最终在5L发酵罐中使β-arbutin产量达81.9 g/L，葡萄糖转化率0.29 g/g，为天然产物生物合成提供了系统性策略。

　　

在化妆品和医药领域，β-熊果苷因其抑制酪氨酸酶(tyrosinase)活性的特性成为热门美白成分，但传统植物提取法效率低下，化学合成又面临异构体选择性和毒性副产物等问题。尽管微生物发酵法具有环境友好优势，但现有技术存在关键酶arbutin synthase(AS)催化效率低、碳通量分配不均以及依赖异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)等昂贵诱导剂等瓶颈。

为突破这些限制，江南大学Zhuoyuan Liu团队在《Technical Innovations》发表研究，通过多维度策略优化大肠杆菌(Escherichia coli)合成体系。研究采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除竞争途径基因(maa/lacA/tyrA等)，整合磷酸酮醇酶(PK)途径基因xfpk并改造乙酸代谢通路；运用Rosetta Dock和AlphaFold预测AS三维结构，通过半理性设计获得R241H突变体；构建luxI/luxR群体感应(QS)系统实现生长-生产的时空调控。

3.1 构建β-熊果苷合成途径

引入Candida parapsilosis的MNX1和Rauvolfia serpentina的AS基因构建基础菌株HD1(0.54 g/L)，通过过表达抗反馈抑制的aroG^fbr、转酮醇酶tktA等关键基因，结合基因组整合技术使产量提升至4.92 g/L(HD8)。

3.2 引入PK途径与乙酸调控

异源表达Bifidobacterium adolescentis的xfpk基因虽增加E4P供给，但导致乙酸积累(768 mg/L)。敲除丙酮酸氧化酶poxB使乙酸降低38.2%，β-熊果苷产量提升至5.85 g/L。

3.3 AS酶工程改造

通过分子对接发现AS活性位点通道存在空间位阻，R241H突变使UDP-葡萄糖(UDPG)与His17距离缩短2?，催化效率提升16.7%，最终产量达6.83 g/L。

3.4 QS系统优化

采用不同核糖体结合位点(RBS)调控酰基高丝氨酸内酯(AHL)积累速率，结合双启动子载体pJ2使菌株HD20产量达7.57 g/L，实现生长-生产自动切换。

3.5 发酵工艺优化

在5L发酵罐中采用pH/溶氧(DO)两阶段控制策略(pH 6.8→6.0，DO 30%→20%)，最终产量创纪录达81.9 g/L，生产效率1.36 g/L/h。

该研究通过代谢网络重构、酶分子设计、动态调控三位一体策略，首次实现无外源诱导剂的高效β-熊果苷生物合成。特别值得注意的是，通过计算机辅助设计的R241H突变体与QS系统的创新结合，不仅解决了毒性中间体对细胞生长的抑制，还为其他天然产物的微生物合成提供了范式。研究展现的"碳通量重定向-酶活性提升-细胞工厂智能化"技术路线，对推动绿色生物制造具有重要启示意义。