双工晶体数字PCR(dPCR)检测技术的开发及其在新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)与番鸭呼肠孤病毒(MDRV)鉴别诊断中的应用

为解决水禽呼肠孤病毒临床鉴别诊断难题，研究人员开发了基于NaicaTM系统的双工晶体数字PCR(dPCR)技术，通过靶向NDRV-S3和MDRV-S2基因设计特异性探针，实现1×10-1 copies/μL的检测限，临床样本检测显示NDRV阳性率8.027%、MDRV阳性率6.020%，为水禽病毒精准防控提供新工具。

　　

近年来，水禽养殖业面临呼肠孤病毒感染的严峻挑战。新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)和番鸭呼肠孤病毒(MDRV)作为两种高致病性病原体，均可导致鸭群免疫器官损伤、继发感染和72小时内死亡，给全球家禽业造成重大损失。这两种病毒引发的肝脏、脾脏病变极为相似，临床鉴别困难，而现有商业疫苗对NDRV交叉保护有限，传统RT-PCR和qPCR方法在灵敏度和特异性方面存在局限。更棘手的是，中国沿海地区已出现1.67%的NDRV/MDRV混合感染病例，亟需开发更精准的检测技术实现早期鉴别诊断。

为突破这一技术瓶颈，Huixin Liu等研究团队在《Veterinary Anaesthesia and Analgesia》发表研究，创新性地将晶体数字PCR(dPCR)技术应用于水禽病毒检测领域。研究采用广西沿海地区299份临床样本，通过靶向NDRV的S3基因和MDRV的S2基因设计特异性引物与探针，优化反应体系后建立双工检测平台。关键技术包括：Naica^TM晶体dPCR系统进行微滴生成与荧光成像，Poisson统计计算绝对拷贝数，并与传统qPCR进行平行比对验证。

3.1. 多重晶体dPCR参数的优化

通过温度梯度实验确定59°C为最佳退火温度，优化后体系含12.5 μL 2×PerfeCta Multiplex qPCR ToughMix UNG和1:10荧光钠盐，NDRV/MDRV引物浓度分别为1.0/1.2 μL，探针浓度0.3/0.4 μL。

3.2. 双工晶体dPCR的特异性

对11种禽源病毒检测显示，仅NDRV和MDRV产生特异性信号，与鸭坦布苏病毒(DTMUV)、H5/H7/H9亚型禽流感病毒(AIV)等常见病原无交叉反应。

3.3. 灵敏度与标准曲线比较

双工dPCR检测限达0.18 copies/μL(NDRV)和0.21 copies/μL(MDRV)，较qPCR灵敏度提升100倍。标准曲线R²值分别为0.9997和1，线性关系优异。

3.4. 双工晶体dPCR的重复性

批内和批间变异系数(CV)均<8%，1.5×10² copies/μL样本的批间CV仅4.37%(NDRV)和4.52%(MDRV)。

3.5. 临床样本评估

299份样本检测显示，dPCR检出NDRV阳性率8.027%、MDRV阳性率6.020%，混合感染率1.672%，与qPCR结果一致性Kappa值达0.977-1。

该研究开创性地将晶体dPCR技术应用于水禽病毒诊断领域，其单分子级别的检测灵敏度可有效监控养殖环境中的病毒载量，为早期疫情预警提供技术支撑。特别值得注意的是，该技术通过可视化微滴芯片实现结果判读，避免了qPCR的假阳性风险，对指导临床用药和疫苗选择具有重要意义。尽管存在设备成本较高、操作复杂度较大等局限，但其在低病毒载量样本检测、疫苗效价评估等方面的独特优势，为水禽呼肠孤病毒的精准防控提供了全新解决方案。研究建立的检测体系不仅适用于中国水禽养殖主产区，也为其他DRV流行国家提供了技术借鉴，对保障家禽业健康发展具有重要实践价值。