细胞游离合成全长人β1肾上腺素受体与Gs蛋白复合物的冷冻电镜结构解析及其信号调控机制研究

本研究通过创新的细胞游离表达系统，成功制备了包含完整第三胞内环(ICL3)的全长人β1肾上腺素受体(HFLβ1AR)与Gs异源三聚体复合物，并利用冷冻电镜技术首次解析了3.3?分辨率的三维结构。该研究揭示了ICL3通过延伸TM5螺旋形成扩展的GPCR/G蛋白界面，阐明了其增强cAMP信号传导的结构基础，为开发靶向GPCR变构位点的新型药物提供了重要理论依据。

　　

在药物研发领域，G蛋白偶联受体(GPCR)家族一直是"明星靶点"，其中β₁肾上腺素受体(β₁AR)作为心血管疾病治疗的重要靶标备受关注。然而长期以来，结构生物学研究面临一个关键瓶颈：为了获得稳定的重组蛋白，研究人员不得不截去受体中高度动态的第三胞内环(ICL3)和末端结构域，这些改造虽然解决了技术难题，却可能掩盖了受体天然构象的重要特征。特别是ICL3区域，虽然已知其能显著增强G_s蛋白偶联效率，但由于结构柔性，在所有已解析的β₁AR结构中均被截短，导致其分子机制成为未解之谜。

为突破这一限制，Felipe Merino等研究者创新性地采用大肠杆菌裂解物体外无细胞(CF)表达系统，将全长人β₁AR共翻译插入纳米盘(ND)膜环境，成功制备了包含完整ICL3的受体与G_s蛋白复合物。这项发表在《Structure》的研究，通过冷冻电镜技术首次捕获了激动剂isoprenaline结合状态下全长受体的精细结构，分辨率达到3.3?，揭示了ICL3调控信号传导的分子机制。

研究团队运用了多项关键技术：1)利用大肠杆菌A19菌株制备高效CF表达系统；2)共翻译将受体插入DOPG脂质纳米盘形成天然膜环境；3)体外重组G_s异源三聚体蛋白；4)冷冻电镜单颗粒分析技术解析复合物结构；5)基于CAMYEL生物传感器的cAMP信号检测系统验证功能。实验设计巧妙地将细胞生物学、结构生物学和生物化学方法相结合，克服了全长GPCR结构解析的传统难题。

研究结果部分包含以下重要发现：

1. 1.

   "Cryo-EM structure of the isoprenaline-bound HFLβ₁AR-G_s complex in nanodiscs"：结构显示HFLβ₁AR与G_s形成1,427?²的扩展界面，显著大于截短受体(1,073-1,103?²)。ICL3的N端五残基(C261^ICL3-F265^ICL3)形成α螺旋延伸TM5，使螺旋长度增加3圈。

1. 1.

   "Structural comparison of the HFLβ₁AR-G_s complex with other active and inactive state β₁AR structures"：与截短受体相比，延伸的TM5呈现弯曲构象，使Q254^5x68向TM6靠近5?，形成新的极性相互作用网络。

2. 2.

   "HFLβ₁AR ICL3 enhances the GPCR/G protein interface"：R263^ICL3/R264^ICL3与Gα_s的hgh4环形成离子键，F265^ICL3与H4疏水相互作用，这些在截短结构中完全缺失。

1. 1.

   "Mutational analysis of the extended HFLβ₁AR-G_s protein-coupling interface"：功能实验显示，删除ICL3和C端使EC₅₀增加130倍；关键残基突变(R263A/R264A/F265A)使效力降低60倍，证实扩展界面增强信号传导。

讨论部分强调了该研究的三大突破：首先，CF表达结合ND技术为全长GPCR结构研究提供了新范式，避免了传统方法必需的截短改造。其次，结构揭示了ICL3通过"双机制"增强信号：直接参与Gα_s结合，同时诱导G蛋白整体旋转形成额外相互作用。最后，发现Gβ亚基与ICL1/H8的新接触，为理解GPCR-G蛋白特异性偶联提供了结构基础。

这项研究不仅解决了β₁AR领域长期存在的结构生物学问题，其技术路线更为其他含长环GPCR的结构解析提供了借鉴。从转化医学角度看，ICL3与G蛋白的精细互作