多靶点肽调节剂设计：靶向Hsp70/Hsp90/Cdc37分子伴侣网络协同抑制肿瘤发生

本研究针对分子伴侣Hsp70和Hsp90在肿瘤发生中的协同作用机制，通过计算模拟与实验验证相结合的策略，成功设计出能同时靶向Hsp70、Hsp90及其共伴侣蛋白Cdc37的多肽抑制剂Cdk4-2。该研究不仅揭示了CDK4激酶不稳定区域与分子伴侣的相互作用模式，更为开发靶向蛋白折叠网络的抗癌药物提供了新范式。

　　

在肿瘤生物学领域，分子伴侣网络犹如细胞的"蛋白质质检员"，其中热休克蛋白Hsp70和Hsp90通过协同作用维持众多致癌蛋白（如激酶CDK4）的稳定性。这两种分子伴侣已成为抗癌药物研发的重要靶点，但现有抑制剂多针对单一靶点，且易引发耐药性。更棘手的是，Hsp70因其高度保守的ATP结合位点，长期以来被视为"不可成药"靶点。如何设计能同时干扰Hsp70/Hsp90协同作用的化合物，成为领域内亟待突破的科学难题。

为破解这一难题，Luca Torielli、Matteo Castelli等跨国研究团队在《Structure》发表创新性研究成果。研究团队采用计算生物学与实验生物学相结合的策略：首先通过分子动力学模拟和MLCE（低能量耦合矩阵）算法预测CDK4激酶的不稳定区域；接着设计模拟这些区域的肽段；运用¹⁹F-NMR、荧光偏振和微尺度热泳等技术验证相互作用；最后通过细胞实验评估生物学效应。

设计模拟CDK4解折叠区域的肽段

研究团队从CDK4激酶晶体结构出发，通过24微秒分子动力学模拟识别出4个最不稳定的结构域（Cdk4-1至Cdk4-4）。其中Cdk4-2（序列LPISTGGFQMALTPVV）和Cdk4-4（GGGFQMALTPVV）在马尔可夫状态模型分析中显示出与天然构象的高度相似性。

CDK4衍生肽在细胞裂解液和肾癌细胞中的结合与促凋亡作用

生物素化肽的pull-down实验证实，0.1μM Cdk4-2即可同时结合Hsp70和Hsp90，而Cdk4-4仅结合Hsp90。在786-O肾透明细胞癌模型中，荧光标记肽显示出良好的膜渗透性，能显著降低CDK4底物Rb蛋白的磷酸化水平（S807/S811），并激活caspase-3介导的凋亡通路。

CDK4衍生肽与Hsp90和Cdc37的结合特性

¹⁹F-T₂滤波NMR实验显示，Cdk4-2和Cdk4-4能以微摩尔级亲和力结合Hsp90和共伴侣蛋白Cdc37。微尺度热泳分析测得Cdk4-2与Hsp90的结合常数K_d≈90μM。

Cdk4-2与Hsp70的高亲和力结合

荧光偏振实验揭示Cdk4-2与Hsc70 SBD（底物结合域）的结合亲和力达29nM，比经典底物NRLLLTG强5倍。通过截短实验鉴定出最小药效团Ac-TGGFQMALT（K_i=120nM），丙氨酸扫描发现Met和Leu残基对结合至关重要。分子对接显示这些疏水残基嵌入Hsp70的Phe428/Gln426/Thr411形成的口袋中。

这项研究开创性地实现了三点突破：首次通过计算指导设计出能同时靶向Hsp70/Hsp90/Cdc37的多肽抑制剂；发现Cdc37通过识别特定序列而非仅物理化学性质选择客户蛋白；开发的Cdk4-2肽成为迄今报道的Hsp70最强结合肽之一。该策略可推广至其他多蛋白机器靶点，为开发靶向蛋白质相互作用网络的药物提供了全新范式。研究也存在局限性，如肽类药物的稳定性和递送效率需进一步优化，未来可通过非天然氨基酸修饰或肽模拟物策略改进。