枸橼酸杆菌SED-1 β-内酰胺酶的碳青霉烯酶假阳性现象：mCIM/eCIM检测中的接种量效应启示

本研究首次报道了非耐药性枸橼酸杆菌（Citrobacter sedlakii）在改良碳青霉烯酶灭活试验（mCIM）中因接种量效应导致的假阳性现象，揭示其染色体编码的SED-1（class A β-lactamase）具有微弱碳青霉烯酶活性。通过全基因组测序（WGS）和液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）验证，提出临床检测中需结合药敏试验（AST）以避免误判，为碳青霉烯酶表型检测标准提供重要修正依据。

　　

ABSTRACT

碳青霉烯酶产肠杆菌（CPE）筛查对高危患者群体至关重要。研究报道了一例从监测培养中分离的枸橼酸杆菌（Citrobacter sedlakii NIH2339），其改良碳青霉烯酶灭活试验（mCIM）呈强阳性，但对碳青霉烯类药物表型敏感。进一步分析显示，该菌株仅携带染色体编码的SED-1（class A β-lactamase），无已知碳青霉烯酶基因。通过接种量梯度实验证实，mCIM检测中高菌量（2.8×10⁸ CFU/mL）可导致假阳性，而标准肉汤微量稀释（BMD）的低菌量（5×10⁵ CFU/mL）则显示敏感。

INTRODUCTION

碳青霉烯酶产肠杆菌（CPE）的快速检测依赖表型方法如mCIM，其通过检测菌株对美罗培南（meropenem）的降解能力判断酶活性。本研究首次发现枸橼酸杆菌SED-1在mCIM高菌量条件下可降解92%美罗培南（LC-MS/MS验证），但常规药敏显示敏感（MIC=0.094 μg/mL）。这一矛盾现象揭示了表型检测的局限性。

MATERIALS AND METHODS

实验采用临床分离株NIH2339，以产KPC酶的肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae ATCC 1705）和非产酶株（ATCC 1706）为对照。通过MALDI-TOF鉴定菌种，Xpert Carba-R PCR排除常见碳青霉烯酶基因，结合WGS（Illumina/Nanopore双平台测序）和RGI数据库分析耐药基因。mCIM/eCIM试验中，EDTA（5 mM）用于区分金属酶（class B）与丝氨酸酶（class A）。

RESULTS

1. 矛盾的碳青霉烯酶活性

NIH2339在mCIM中完全降解美罗培南（无抑菌圈），eCIM试验却显示EDTA抑制现象（抑菌圈6→14 mm），疑似金属酶。但WGS仅检出bla_SED-1，且美罗培南-EDTA协同试验阴性，排除了金属酶可能。

2. 接种量效应的关键作用

梯度稀释实验显示，mCIM菌量降低至1/8时，抑菌圈恢复（15 mm）。BMD证实高菌量（10⁸ CFU/mL）使MIC升至>8 μg/mL，而标准菌量（10⁵ CFU/mL）MIC为0.25 μg/mL。

3. SED-1的弱酶活性机制

基因组分析发现bla_SED-1所在17.7 kb区域存在多拷贝重复（测序深度8.56×），可能导致表达量升高。添加雷利巴坦（relebactam，class A/C/D抑制剂）后，mCIM抑菌圈增大，进一步证实SED-1的弱碳青霉烯酶活性。

DISCUSSION

本研究揭示了mCIM/eCIM在非耐药菌株中的假阳性风险：

1. 1.

   临床意义：高菌量（如脓肿感染）可能导致碳青霉烯治疗失败，需结合AST结果综合判断；

2. 2.

   方法学启示：LC-MS/MS定量检测可辅助验证酶活性，弥补表型检测的不足；

3. 3.

   进化视角：SED-1的弱酶活性提示β-内酰胺酶功能可塑性，需警惕其潜在耐药进化。

CONCLUSION

枸橼酸杆菌SED-1通过接种量效应干扰mCIM/eCIM结果的现象，为临床实验室提供了重要质控参考。未来需探索更多菌株中SED-1的酶动力学特征，并优化检测流程以避免过度报告碳青霉烯酶阳性。