马流感病毒核蛋白抗体的NP-cELISA检测方法的开发与应用及其在中国血清流行病学调查中的意义

这篇研究开发了一种基于单克隆抗体的竞争性酶联免疫吸附试验（NP-cELISA），用于高效检测马流感病毒（EIV）核蛋白（NP）抗体。该方法通过包被特异性单抗1E10，结合HRP标记的NP抗原，实现一步式反应（70分钟完成检测），灵敏度达100%（HI效价256×），特异性为100%，且与金标准HI试验的符合率（87.4%）优于商用ID.vet-cELISA（78.2%）。研究首次揭示中国2021-2023年马群EIV抗体平均阳性率37.96%，为马流感（EI）防控提供了重要工具和流行病学数据。

　　

Development and application of a NP-cELISA for the detection of nucleoprotein antibodies of equine influenza virus

ABSTRACT

马流感（EI）是由马流感病毒（EIV）引起的急性呼吸道疾病，已在全球范围内呈地方性流行，频繁暴发导致马产业重大经济损失。本研究开发了一种竞争性酶联免疫吸附试验（NP-cELISA），通过包被抗NP单克隆抗体（mAb），使待测血清与HRP-NP抗原竞争结合，实现EIV NP抗体的高灵敏度检测。受试者工作特征（ROC）曲线分析显示，该方法的敏感性和特异性均达100%。在119份临床样本的平行测试中，NP-cELISA与血凝抑制（HI）试验的符合率为87.4%，显著高于商用ID.vet-cELISA（78.2%）。2021-2023年中国血清学监测显示，马群EIV抗体年均阳性率为37.96%。

IMPORTANCE

EI的高度传染性对全球马业造成巨大经济负担。当前HI检测虽准确但操作复杂，而中国缺乏商用检测试剂盒。本研究开发的NP-cELISA具有快速（70分钟）、低成本和高通量优势，且首次揭示了中国EI流行状况，为疾病防控提供关键工具。

INTRODUCTION

A型流感病毒（IAV）可感染包括马、禽、猪等多种宿主。EIV被认为源自禽类跨种传播，其表面蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的抗原漂移（antigenic drift）与抗原转换（antigenic shift）导致病毒持续进化。EI被世界动物卫生组织（WOAH）列为须通报疾病，2007年日本和澳大利亚的疫情曾造成数十亿美元损失。

现有诊断方法中，HI和单径向溶血试验（SRH）是WOAH推荐标准，但操作繁琐。NP作为IAV最保守的蛋白（91.4%-99.4%同源性），可区分A/B/C/D型流感病毒，是理想诊断靶标。

MATERIALS AND METHODS

1. 1.

   蛋白表达：将EIV（H3N8亚型，XJ谱系）NP基因克隆至pCAGGS/pET28a载体，分别在HEK293T细胞（真核表达）和E.coli BL21（原核表达）中制备GST-NP和His-NP蛋白。

2. 2.

   单抗制备：采用DNA初免-蛋白加强策略免疫BALB/c小鼠，筛选出具有强竞争活性的1E10单抗（Western blot验证其与多种IAV NP交叉反应）。

3. 3.

   NP-cELISA建立：以1E10包被板，优化血清稀释度（1:8）和反应条件，临界值（Cut off）设为55%抑制率（PI）。

RESULTS

1. 1.

   性能验证：

   • •

     特异性：与马疱疹病毒（EHV-1/4）、马动脉炎病毒（EAV）等无交叉反应，但可检测禽流感（H7N4/H9N2）NP抗体。

   • •

     灵敏度：最高检测稀释度256×（等同HI效价），批间重复性良好。

   • •

     临床样本：在119份样本中，NP-cELISA检出率（69.7%）显著高于ID.vet-cELISA（55.5%）。

2. 2.

   免疫监测：接种灭活疫苗的马匹中，NP-cELISA最早在第5天检出抗体（HI试验需7天），且抗体持续时间更长（94天未下降，而HI效价66天转阴）。

3. 3.

   流行病学：中国21省份3,451份样本显示，EI抗体阳性率存在地域差异——北方最高（51.61%），东北最低（20.74%），湖北（94.11%）和贵州（65.16%）等地区异常高发。

DISCUSSION

本研究创新性在于：

1. 1.

   靶标选择：NP的保守性使检测不受HA/NA抗原变异影响，适用于多亚型IAV筛查。

2. 2.

   技术优化：一步法反应较传统ELISA节省80分钟，且无需物种特异性二抗。

3. 3.

   应用价值：弥补了中国商用试剂盒空白，并为疫苗免疫效果评估提供新工具。

局限性包括未验证其他动物IAV（如猪、禽）临床样本的适用性。未来可拓展至跨物种流感监测网络建设。

ACKNOWLEDGMENTS

感谢黑龙江省自然科学基金（TD2022C006）、国家重点研发计划（2021YFD1800500）等项目的资助。