塞内卡病毒A在顶向外猪肠道类器官中的复制机制及应激颗粒与先天免疫应答研究

本研究创新性构建顶向外（apical-out）猪肠道类器官模型，揭示塞内卡病毒A（SVA）通过肠上皮细胞（enterocytes）→肠内分泌细胞（enteroendocrine cells）→潘氏细胞（Paneth cells）→肠道干细胞（Lgr5+）→增殖细胞的感染时序，首次证实SVA诱导的应激颗粒（SGs）在4 hpi形成、20 hpi消失的动态特征，并发现干扰素（IFN-α）、ISG-15、OAS1/2等先天免疫通路激活可限制病毒复制，为控制继发感染提供新靶点。

　　

Establishment of apical-out porcine intestinal organoids culture system

研究团队从7日龄仔猪空肠隐窝分离干细胞，通过三维（3D）培养成功构建包含肠道干细胞（Lgr5⁺）、肠上皮细胞（villin⁺）、杯状细胞（Muc2⁺）、潘氏细胞（lysozyme⁺）等6种细胞亚群的类器官。创新性采用10 μM Y-27632悬浮培养实现极性反转，免疫荧光证实顶膜蛋白ZO-1由管腔内侧移位至外层，而基底蛋白β-catenin在管腔富集，形成生理结构更接近体内的顶向外模型。

Proliferation of SVA in apical-out porcine intestinal organoids

以MOI=6接种SVA-LJ2021毒株后，类器官24小时内出现囊泡结构崩解。病毒载量检测显示12 hpi达到复制峰值（2.9×10⁷ copies/μL），较1 hpi增长60倍。免疫荧光共定位证实病毒N蛋白主要分布于顶膜ZO-1阳性区域，提示病毒通过顶膜途径入侵。

Identification of cellular subpopulations in SVA-infected organoids

时序性双标免疫荧光揭示SVA感染存在明确级联：4 hpi首先入侵肠上皮细胞，8 hpi扩散至肠内分泌细胞（ChgA⁺），12 hpi感染潘氏细胞和肠道干细胞，20 hpi最终波及增殖细胞（Ki67⁺）。值得注意的是，杯状细胞全程未检测到病毒侵染，表明其可能具有天然抗性。

Alteration of SGs pattern in infected organoids

G3BP1蛋白标记显示，应激颗粒（SGs）在4 hpi形成典型点状聚集体，占比达68.3±5.2%；随着感染进程，12 hpi降至32.1±4.7%，20 hpi几乎完全消失。这种瞬时SG形成特征与SVA 3C蛋白酶介导的eIF4GI-G3BP1相互作用破坏机制相符。

Transcriptional changes in antiviral-related genes

RT-qPCR分析发现24 hpi时先天免疫通路显著激活：干扰素IFN-α上调9倍，ISG-15升高11倍，OAS1/OAS2分别增加8.4/6.3倍。STAT1信号转导因子及黏膜免疫基因Muc2同步上调，同时促炎因子IL-6表达激增，这种多通路协同应答可能是后期（48 hpi）病毒载量下降的关键因素。

Discussion

该研究首次在类器官层面阐明SVA的肠上皮感染模式：病毒通过"肠上皮细胞→分泌细胞→干细胞"的级联感染破坏肠道屏障，而早期应激颗粒（SGs）的瞬时形成可能为病毒逃逸宿主防御创造时间窗口。后期ISG-15/OAS系统激活和黏膜免疫强化构成的"三道防线"（干扰素应答、抗病毒蛋白分泌、物理屏障修复）为开发靶向干预策略提供了理论依据。这种顶向外类器官模型为研究其他猪肠道病毒（如TGEV、PEDV）的致病机制提供了新平台。