G2期p21-CDK氧化还原开关调控细胞增殖-周期退出命运的关键机制

本研究揭示了活性氧（ROS）通过氧化细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21的C41位点（S-sulfenylation），在G2期动态调控其稳定性，从而决定细胞增殖或衰老命运。研究人员采用细胞周期分辨的氧化蛋白质组学技术，发现p21-CDK2负反馈环路受C41氧化状态控制：当C41保持还原态时，p21稳定性增强并促进辐射后细胞衰老。这一发现为理解氧化应激与细胞命运决策的分子联系提供了新视角。

　　

在生命活动过程中，细胞如何根据环境信号决定继续增殖还是退出周期进入休眠或衰老状态，一直是细胞生物学领域的核心问题。活性氧（ROS）作为重要的信号分子，其水平会随着细胞周期进程波动，但具体通过哪些靶蛋白、以何种机制影响细胞命运决策，此前知之甚少。尤其令人困惑的是，尽管已知氧化应激会促进细胞衰老，但增殖活跃的细胞本身也会产生周期性ROS波动，这两者如何协调统一成为亟待解决的矛盾。

这项发表在《Molecular Cell》的研究，由Julia Vorhauser等科学家团队完成，首次揭示了细胞周期核心调控因子p21蛋白上的"氧化还原开关"如何整合ROS信号与细胞周期调控网络。研究人员通过创新性地结合细胞周期同步化技术、动态氧化蛋白质组学（BTD标记）和基因编辑手段，发现p21第41位半胱氨酸（C41）在G₂期的特异性氧化修饰，能够像"分子调速器"一样控制细胞命运的走向。

关键技术方法包括：1）开发细胞周期分辨的S-磺酰化蛋白质组学技术，在人类视网膜色素上皮细胞（RPE-1）中鉴定1,724个氧化位点；2）利用CRISPR-Cas9基因编辑构建p21-C41S突变细胞系；3）建立靶向p21的局部氧化还原调控系统（TRX/DAAO融合蛋白）；4）结合活细胞成像、免疫共沉淀和质谱定量分析蛋白互作与稳定性。

细胞周期分辨的氧化蛋白质组学揭示动态修饰模式

通过将CDK4/6抑制剂palbociclib同步化与BTD探针标记相结合，研究人员首次绘制了细胞周期各阶段特异的S-磺酰化图谱。尽管整体蛋白质氧化水平保持稳定，但发现233个半胱氨酸位点呈现细胞周期依赖性动态修饰，其中p21-C41在G₂期氧化水平最高。

p21在G₂期特异性氧化于C41位点

结构分析显示C41位于p21-CDK4-cyclin D三聚体界面，与CDK4-C78（同样被氧化的残基）相距仅6?。质谱定量表明G₂期C41氧化比例达12%，而其他半胱氨酸（C13/C117）氧化率不足7%。免疫沉淀实验证实内源性p21在生理状态下持续被氧化。

C41S突变增加p21蛋白水平并抑制增殖

通过同源重组构建的p21-C41S突变体表现出：1）基础p21-GFP阳性细胞比例从7%升至11%；2）视网膜母细胞瘤蛋白（RB）磷酸化水平降低；3）细胞周期延长3.5小时；4）在竞争性生长实验中20天后几乎被野生型细胞完全淘汰。活细胞成像显示突变体在G₂期和分裂期p21水平异常升高，导致子细胞继承更多p21并延长G₁期。

氧化还原状态调控p21-CDK2反馈环路

机制研究发现：1）还原态C41增强p21与CDK2结合，抑制CDK2活性；2）阻碍CDK2介导的p21-S130磷酸化，抑制SCF-SKP2泛素化降解途径；3）G₂期p21半衰期从2.5小时延长至5小时以上。而磷酸化模拟突变S130D可逆转C41S的稳定化效应，证实该通路层级关系。

C41氧化状态决定细胞应激响应命运

在辐射（2Gy）或Nutlin-3处理后，C41S细胞表现出：1）G₂期p21^high细胞比例加倍；2）6天后β-半乳糖苷酶活性显著增强；3）细胞核增大等典型衰老特征。通过靶向表达硫氧还蛋白（TRX）或D-氨基酸氧化酶（DAAO）局部调控p21氧化状态，证实仅C41氧化还原变化就足以改变p21水平和细胞命运。

这项研究的重要意义在于：首先，阐明了ROS通过p21-C41氧化动态调控"增殖-退出"命运