RNA反式剪接修复β-连环蛋白：治疗CTNNB1单倍体不足障碍的创新策略

《Molecular Therapy Nucleic Acids》：RNA trans-splicing to rescue β-catenin: A novel approach for treating CTNNB1-Haploinsufficiency disorder

本研究针对CTNNB1单倍体不足综合征这一罕见神经发育障碍，开发了基于剪接体介导RNA反式剪接(SMaRT)的创新疗法。研究人员设计靶向CTNNB1内含子的前反式剪接RNA分子(PTM)，结合反义RNA(asRNA)和自切割核酶优化，成功实现内源性CTNNB1转录本修复，为突变非依赖型治疗提供新思路。该成果发表于《Molecular Therapy Nucleic Acids》，为剂量敏感基因疾病的治疗开辟新途径。

　　

在神经发育障碍研究领域，CTNNB1单倍体不足综合征因其复杂的发病机制和缺乏有效治疗手段而备受关注。这种由CTNNB1基因功能缺失突变引起的罕见疾病，表现为运动和认知功能障碍，发病率约为2.6-3.2/10万新生儿。由于CTNNB1基因的剂量敏感性——既不能表达不足也不能过度表达，传统基因替代疗法面临巨大挑战。更棘手的是，该基因突变类型多样且分布广泛，从点突变到大片段缺失都有报道，亟需开发一种能同时解决突变多样性和维持内源性基因调控的普适性治疗方案。

针对这一科学难题，来自斯洛文尼亚国家化学研究所的Maruna等研究团队在《Molecular Therapy Nucleic Acids》发表创新性研究成果。他们另辟蹊径地采用剪接体介导RNA反式剪接(Spliceosome-mediated RNA trans-splicing， SMaRT)技术，通过精心设计的前反式剪接RNA分子(pre-trans-splicing molecules， PTM)，成功修复了致病突变转录本，同时保留了内源性基因调控机制。这项研究不仅为CTNNB1综合征提供了首个RNA修复方案，也为其他剂量敏感基因疾病的治疗提供了范式转移。

研究人员主要采用了四项关键技术：1) 基于MaxEnt算法的剪接位点预测筛选靶向内含子；2) 分裂黄色荧光蛋白(YFP)报告系统定量评估PTM效率；3) 设计U1-U7杂合表达盒递送靶向剪接调控元件的反义RNA(asRNA)；4) 在PTM的5'端引入自切割核酶(Twister/HDV)增强核保留。实验采用HEK293T细胞模型，通过流式细胞术、Western blot和定量PCR等多层次验证。

【设计支持CTNNB1内含子反式剪接的PTM候选分子】

通过计算预测筛选出内含子2、5、6作为靶点，设计包含150nt结合域(BD)的PTM文库。分裂YFP报告系统显示PTM K2.3、K5.2和K6.5分别使YFP⁺细胞比例提升15%-55%，其中K6.5的荧光强度增加3倍。实验证实反式剪接具有高度特异性，且较长的BD更有效。

【反义RNA显著增强PTM介导的反式剪接】

创新性地设计靶向分支点(BP)和3'剪接位点(3'SS)的30-35nt asRNA，通过U1-U7杂合载体表达。asRNA BP4使K2.3效率从19%提升至48%，SC35使K5.2效率从16%跃升至55%。Western blot和测序证实asRNA通过抑制顺式剪接显著增强反式剪接效率。

【5'端自切割核酶显著增强3'反式剪接】

首次在PTM的5'端引入Twister和HDV核酶，通过去除5'帽结构增强核保留。5'HDV-K2.3使效率提升2倍，突变核酶则丧失增强效果。TopFlash报告实验证实核酶有效阻止PTM的泄漏翻译。

【CMV启动子表达增强内含子2和5的PTM反式剪接】

比较发现CMV启动子驱动的PTM表达量更高，使K2.3效率进一步提升。结合5'核酶和asRNA的多重优化使K2.3效率达到最高水平，Western blot显示内源性CTNNB1转录本成功修复。

【内源性CTNNB1的反式剪接】

最终验证阶段，将优化后的PTM应用于内源性CTNNB1。半定量PCR检测到2435bp的特异性条带，测序证实外显子2与PTM携带的野生型序列正确拼接。这是首次实现CTNNB1内源性转录本的反式剪接修复。

这项研究的意义在于：1) 首次将SMaRT技术应用于CTNNB1综合征治疗，克服了基因剂量敏感性的难题；2) 开发了asRNA和5'核酶等创新优化策略，将效率提升至治疗水平；3) 证实内源性基因修复的可行性，为临床转化奠定基础。特别值得注意的是，该方法不同于传统基因替代疗法，能精确维持生理水平的β-catenin表达，避免了过度表达的风险。虽然目前还存在递送效率等挑战，但该研究为300多种CTNNB1突变提供了一站式解决方案，也为其他神经发育障碍如FOXG1、EHMT1等疾病的治疗开辟了新路径。未来研究可进一步优化单载体递送系统，并探索AAV载体在动物模型中的治疗效果。