Blebbistatin通过降低心肌细胞钙缓冲能力影响细胞电生理特性的机制研究

这篇研究揭示了Blebbistatin（一种肌球蛋白II ATP酶抑制剂）通过降低诱导多能干细胞来源的心房肌细胞（iPSC-aCM）内钙离子（Ca2+）缓冲能力，导致舒张期和收缩期Ca2+水平升高、肌浆网（SR）Ca2+泄漏增加，并改变L型钙电流（ICa,L）失活动力学和内向整流钾电流（IK1）密度，最终形成致心律失常基质。研究通过同步膜片钳和荧光显微技术，结合高通量自动化膜片钳，首次阐明其机制与Ca2+缓冲亲和力下降（Kd增加）直接相关，且可被EGTA（乙二醇双四乙酸）逆转，为光学标测实验中该药物的应用提供了重要警示。

　　

引言

Blebbistatin作为肌球蛋白II ATP酶抑制剂，广泛应用于心脏光学标测研究以实现兴奋-收缩（EC）解耦联。然而，近期证据表明其可能通过延长动作电位时程和间接调节Ca²⁺敏感性，增加心律失常易感性。心房颤动（AF）中，Ca²⁺缓冲受损是关键病理因素，而心肌细胞内99%的Ca²⁺与缓冲蛋白结合，微小的缓冲扰动即可显著改变游离Ca²⁺浓度。本研究旨在探究Blebbistatin是否通过选择性破坏Ca²⁺缓冲，进而诱发致心律失常的Ca²⁺处理和电生理改变。

方法

研究使用人诱导多能干细胞分化的心房肌细胞（iPSC-aCM），通过同步全细胞膜片钳和荧光显微技术评估Ca²⁺处理，并结合高通量自动化膜片钳分析离子通道功能。Ca²⁺缓冲特性通过咖啡因诱导的肌浆网Ca²⁺释放实验量化，采用Michaelis-Menten方程拟合缓冲曲线。此外，通过共聚焦显微镜检测Ca²⁺火花（Ca²⁺ sparks）频率以评估SR Ca²⁺泄漏。

结果

Blebbistatin降低iPSC-aCM的Ca²⁺缓冲能力

10 μmol/L Blebbistatin处理显著增加缓冲解离常数（K_d），表明Ca²⁺缓冲亲和力下降，同时舒张期和收缩期Ca²⁺水平分别升高48%和55%。尽管肌浆网Ca²⁺含量和最大缓冲容量（B_max）未受影响，但Ca²⁺火花频率和SR Ca²⁺泄漏显著增加，提示自发性Ca²⁺释放事件（SCaEs）风险升高。

对离子通道的次级影响

Blebbistatin未改变钠电流（I_Na）和L型钙电流（I_Ca,L）峰值密度，但显著增强I_Ca,L的Ca²⁺依赖性失活（CDI），并降低I_K1密度达35%。这些变化在EGTA螯合细胞内Ca²⁺后完全逆转，证实其为Ca²⁺缓冲受损的继发效应。

讨论

研究首次揭示Blebbistatin通过降低肌丝（主要Ca²⁺缓冲体系）对Ca²⁺的亲和力，导致游离Ca²⁺动态失衡。升高的舒张期Ca²⁺通过激活钙调蛋白激酶II（CaMKII）等通路，可能进一步促进心律失常基质。值得注意的是，I_K1密度下降与细胞内多胺介导的整流特性改变相关，而I_Ca,L失活加速可能反映局部Ca²⁺微域信号传导的紊乱。

治疗展望

研究建议在光学标测实验中联合使用EGTA或Ca²⁺增敏剂（如EMD57033）以抵消Blebbistatin的副作用。针对AF治疗，调控肌钙蛋白C（cTnC）等Ca²⁺缓冲蛋白的策略可能比传统离子通道阻滞更具靶向性。

局限性

尽管iPSC-aCM模型存在成熟度限制，但研究通过晚期分化细胞（35-40天）和自动化技术增强了数据可靠性。未来需在三维心肌组织和大型动物模型中验证结论，并探索CaMKII/钙调神经磷酸酶等下游信号的影响。

结论

Blebbistatin作为研究工具虽可实现EC解耦联，但其通过损害Ca²⁺缓冲诱发的电生理紊乱不容忽视。该发现不仅为光学标测实验设计提供警示，也为AF中Ca²⁺缓冲靶向治疗开辟了新思路。