敲除miR-30a-5p并重建肌动蛋白网络动态部分恢复体外血细胞培养中受损的终末红细胞分化

本研究针对体外红细胞(RBC)生产过程中核排出(enucleation)效率低下的关键瓶颈问题，通过CRISPR/Cas9技术敲除miR-30a-5p抑制剂，结合转录组和蛋白质组分析发现c-Myc过表达导致的细胞骨架紊乱。研究人员通过靶向调控BCL-XL和肌动蛋白切割蛋白scinderin(SCIN)，使永生化红系祖细胞系(imBMEP-A)的终末分化效率提升22.1±1.7%，为罕见血型患者的治疗性红细胞生产提供了新策略。

　　

在输血医学领域，体外生产功能性红细胞（称为"blood pharming"）被视为解决稀有血型患者输血难题的革命性技术。然而这项技术始终面临着一个关键瓶颈——来源于永生细胞系、iPSCs或多能干细胞的红细胞核排出(enucleation)效率极低，导致无法规模化生产。核排出是红细胞成熟过程中最神秘的生物学现象之一，涉及染色质浓缩、核迁移和肌动蛋白环收缩等复杂过程，其效率直接影响最终产品的临床适用性。

德国德累斯顿工业大学Romy Kronstein-Wiedemann团队在《Stem Cell Reviews and Reports》发表的研究，首次从成人骨髓CD71⁺红系前体细胞建立的永生化红系祖细胞系(imBMEP-A)入手，通过多组学分析和基因编辑技术，系统解析了影响核排出的分子机制。研究人员采用CRISPR/Cas9基因编辑、RNA-seq转录组分析、质谱蛋白质组学、流式细胞术和活细胞成像等关键技术，样本来源于德国红十字会提供的骨髓CD34⁺造血干细胞(HSCs)。

miR-30a-5p敲除促进终末红系分化

通过双sgRNA策略敲除已知的核排出抑制因子miR-30a-5p后，imBMEP-miR30a-K.O.细胞系的核排出率从3.3±0.4%提升至8.9±1.7%。血红蛋白亚型分析显示，该细胞系能同时表达胎儿(HBG)和成人(HBB)血红蛋白，但成人血红蛋白占比仅20-30%。流式检测CD36/CD235a标记显示，敲除组orthochromatic erythroblasts（正染性幼红细胞）数量显著增加。

多组学揭示细胞骨架调控异常

转录组和蛋白质组比较发现，imBMEP-A与HSCs存在6000多个基因和1300多个蛋白的差异表达。通路分析显示，永生化的关键因子c-Myc过表达导致代谢重编程和细胞骨架紊乱，其中肌动蛋白切割蛋白scinderin(SCIN)和villin 1(VIL1)异常高表达。Western blot证实SCIN在HSCs中完全缺失，而在imBMEP-A中持续高表达。

SCIN敲除恢复肌动蛋白网络动态

CRISPR敲除SCIN后，F-actin免疫荧光显示肌动蛋白纤维分布更均匀，自发性核排出细胞增多。特别值得注意的是，红细胞膜骨架关键蛋白Band 3表达恢复至HSCs水平，orthochromatic erythroblasts数量增加22.1±1.7%。但最终核排出率仍未显著提升，提示存在其他限制因素。

BCL-XL调控延缓凋亡但不足够

由于imBMEP-A中抗凋亡因子BCL-XL表达低于HSCs，研究人员使用CRISPR/dCas9激活内源性BCL-XL表达。虽然早期凋亡细胞减少，但晚期凋亡仍持续发生，且对终末分化无显著改善。核型分析显示所有细胞系均存在复杂的染色体异常，可能影响其稳定性。

这项研究首次系统阐明了永生化红系细胞核排出效率低下的多重机制：c-Myc驱动的代谢异常、SCIN介导的肌动网络紊乱和BCL-XL相关的凋亡抵抗缺陷。虽然单独干预SCIN能部分恢复细胞骨架动态和终末分化，但要实现临床级红细胞生产仍需多靶点协同调控。该工作不仅为优化imBMEP-A细胞系提供了明确方向，也为理解红白血病病理机制提供了新视角。特别是发现SCIN作为红系分化中的新型调控因子，为开发促进核排出的小分子药物提供了潜在靶点。未来研究需要整合更多红系特异性因子（如KLF1、HEMGN等）的调控网络，才能最终突破体外红细胞生产的规模化瓶颈。