整合素α、踝蛋白及肾母细胞瘤过表达基因在棘皮动物骨骼形成中的表达谱及Npnt蛋白的功能解析

这篇研究揭示了海胆（Paracentrotus lividus）骨骼形成中整合素α（Integrin α）、踝蛋白（Talin）和细胞外基质蛋白Npnt的时空表达模式，证实Npnt通过VEGF信号依赖机制调控骨骼生长与形态，为无脊椎动物生物矿化（biomineralization）的细胞-基质互作机制提供了新见解。

　　

1 引言

生物矿化（Biomineralization）是生物体利用矿物质构建骨骼、贝壳等硬组织的关键过程。脊椎动物的生物矿化依赖细胞外基质（ECM）分泌和整合素（Integrin）介导的黏着斑形成，但无脊椎动物中相关机制尚不明确。海胆幼虫的钙质骨针（spicule）周围存在黏着斑结构，提示细胞-基质互作可能调控其骨骼形成。本研究以地中海海胆（Paracentrotus lividus）为模型，系统分析了整合素α基因（Pl-ahi、Pl-aji、Pl-api）、踝蛋白（Pl-Talin）和ECM蛋白Npnt的表达与功能。

2 方法

通过转录组数据筛选候选基因，采用全胚胎原位杂交（WMISH）解析时空表达；利用VEGFR抑制剂Axitinib处理胚胎验证信号调控；设计两种Npnt翻译阻断型吗啡啉寡核苷酸（MO）进行功能缺失实验；免疫荧光检测磷酸化黏着斑激酶（pFAK）活性。

3 结果

3.1 骨骼形成相关黏附基因的鉴定

单细胞RNA-seq发现Pl-ahi、Pl-aji、Pl-api和Pl-talin在骨骼形成细胞（skeletogenic cells）中富集。序列比对显示这些蛋白在人类与海胆间高度保守：Pl-Ahi与人类ITGA9同源，含5个β-螺旋桨重复结构域；Pl-Aji类似ITGAV，保留FG/GAP基序；Pl-Talin的FERM结构域和螺旋束与哺乳动物同源。

3.2 Npnt的独特特征与表达调控

海胆Npnt的N端5个表皮生长因子样（EGF-like）结构域高度保守，但缺失脊椎动物特有的RGD整合素结合位点。WMISH显示Pl-npnt从原肠胚早期（20 hpf）至幼体阶段（48 hpf）持续在骨骼形成细胞中表达，且该表达依赖VEGF信号通路——抑制VEGFR导致骨骼细胞特异性表达缺失。

3.3 Npnt功能缺失的表型分析

Npnt-MO注射导致骨骼生长延迟、骨针长度缩短（p<0.001），并诱发异位分支和额外骨针形成。值得注意的是，pFAK在突变体骨针周围仍正常激活，且骨骼细胞迁移未受影响，证实海胆Npnt不依赖整合素-FAK通路发挥作用。

4 讨论

4.1 黏附机器在骨骼形成中的进化视角

整合素α和Pl-Talin在骨骼细胞迁移期的富集提示其可能参与早期黏着斑组装。与脊椎动物骨重塑中ITGAVβ3的作用类似，Pl-Aji在骨针形成簇的富集暗示跨物种功能保守性。

4.2 Npnt的非经典作用机制

尽管缺乏RGD基序，Npnt仍通过以下途径调控骨骼形态：

1）EGF样结构域可能激活EGFR-ERK通路，调控晶体沉积空间限制；

2）C端类SUSHI结构域介导ECM蛋白互作，影响碳酸钙成核；

3）钙结合基序稳定其在矿化微环境中的功能。

4.3 生物矿化的趋同进化

海胆骨骼形成与脊椎动物血管生成共享基因调控网络（GRN），但均独立演化出ECM-黏附蛋白调控机制，反映生物矿化对细胞-基质互作的普遍需求。

结语

该研究首次揭示Npnt在无脊椎动物生物矿化中的非经典功能，为理解骨骼发育的进化保守性与多样性提供了新视角。后续研究可聚焦Npnt-ECM互作的具体生化机制及其在再生医学中的潜在应用。