阴道毛滴虫短内含子的异常可塑性及反式剪接能力揭示剪接体在进化分歧原生生物中的多样化机制

研究人员针对阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis）内含子剪接机制不明的问题，通过构建荧光报告系统结合突变分析，揭示了其短内含子家族独特的剪接信号特征（如高度简并的5'剪接位点GTWYNN和极端的分支点-3'SS间距），并首次证实该生物具备反式剪接能力。这项发表于《International Journal of Particle Therapy》的研究为理解真核生物剪接体进化多样性提供了新视角。

　　

在真核生物中，内含子（intron）作为基因组的重要非编码元件，其剪接机制一直是分子进化研究的核心问题。然而，对于阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis）这类高度分歧的原生生物寄生虫，其内含子特征长期存在两大谜团：一是基因组中仅存少量内含子却呈现显著长度分化（25-26 nt的短内含子vs. 59 nt以上的长内含子），二是剪接信号保守性与其他单细胞真核生物（如酵母或贾第鞭毛虫）存在明显差异。更引人深思的是，与其亲缘关系较近的贾第鞭毛虫（Giardia lamblia）已被证实存在反式剪接（trans-splicing）现象，但阴道毛滴虫是否具备这种能力尚属未知。这些空白不仅阻碍了对早期真核生物剪接体进化路径的理解，也可能影响对该寄生虫基因调控机制的全面认识。

为破解这些难题，Khatima Mohammadi团队开发了创新的iLOV（improved Light-Oxygen-Voltage）荧光报告系统。这种基于厌氧微生物优化的荧光蛋白克服了传统GFP在阴道毛滴虫中的表达限制，通过在内含子插入位点（iLOV第98-99 nt）引入框架移位设计，使荧光强度与剪接效率直接关联。研究选取TVAG_043580基因的25 nt内含子（25i）和TVAG_416520基因的26 nt内含子（26i）作为短内含子模型，通过流式细胞术（FACS）和RT-PCR双验证系统，实现了剪接活性的定量与定性分析。

iLOV作为阴道毛滴虫剪接活性报告基因的验证

通过对比野生型26i-WT与分支点腺苷酸突变的26i-M1，研究证实iLOV系统能准确反映剪接状态：26i-WT产生117 bp剪接产物且荧光强度与无内含子iLOV相当，而26i-M1仅检测到143 bp未剪接mRNA且荧光消失。该系统灵敏度足以区分单核苷酸变异对剪接的影响。

短内含子剪接信号的特征解析

研究发现短内含子5'剪接位点（5'SS）呈现惊人简并性——尽管必须保留GT起始，但下游4个核苷酸（GTWYNN）几乎可任意替换（25i-M2至-M6突变体均保持活性）。相比之下，3'剪接位点（3'SS）的AG双核苷酸和分支点序列（YCTAA^AC）则严格保守，其中分支点首位必须为嘧啶（25i-M10/M11失活而25i-M12保留活性）。这种"松-紧"组合的剪接信号模式完全不同于长内含子的RCTAA^AC保守特征。

短内含子长度可塑性的边界探索

通过系统插入缺失突变，研究首次界定短内含子的空间约束：5'SS与分支点间距可延长至13 nt（25i-M13）但不能短于6 nt（25i-M16失活）；更惊人的是分支点与3'SS间距可压缩至仅1 nt（25i-M20），但超过6 nt（25i-M18）即导致剪接失败。这种极端的BS-3'SS并置现象在真核生物中尚属首次报道，暗示阴道毛滴虫可能采用独特的剪接体扫描机制。

阴道毛滴虫反式剪接能力的发现

研究通过双质粒系统（分别携带iLOV外显子1-内含子5'片段^NeoR和外显子2-内含子3'片段^PACR）证实：当引入贾第鞭毛虫HSP90基因的天然分裂内含子或人工分裂的阴道毛滴虫TATA-box内含子时，双转染细胞荧光强度与cis对照相当（p<0.05），且RT-PCR检测到255 bp的跨外显子产物。分支点突变（in-trans BS-C）则完全阻断该过程，确认为反式剪接依赖机制。

这项研究从根本上改写了人们对阴道毛滴虫RNA加工机制的认知：首先，其基因组中存在两种剪接信号体系迥异的内含子家族，短内含子通过极简的BS-3'SS并置补偿5'SS简并性；其次，该生物与贾第鞭毛虫共享反式剪接能力，暗示反式剪接可能在Metamonada超群中具有更古老的进化起源。从技术层面看，iLOV报告系统为厌氧微生物的剪接研究提供了通用工具；从医学角度，这些发现为理解阴道毛滴虫（全球最普遍非病毒性传播病原体）的基因调控网络奠定基础，其独特的剪接机制也可能成为抗寄生虫药物开发的新靶点。

研究同时提出若干待解问题：短内含子BS-3'SS极端并置是否反映剪接体组分缺失？反式剪接是否存在于阴道毛滴虫天然基因中？回答这些问题需要结合转录组学与冷冻电镜等结构生物学手段。正如作者强调，对这类非模式生物基础机制的探索，将持续为真核生物进化研究提供"意外之喜"。