新型嗜盐热菌Halothermothrix orenii纤维糊精磷酸化酶的鉴定及其在纤维三糖合成中的应用

《Molecular Catalysis》：Characterization of a novel halothermothrix orenii cellodextrin phosphorylase and its application in cellotriose synthesis

本文鉴定了一种来自嗜盐热菌Halothermothrix orenii的新型纤维糊精磷酸化酶(HoCDP)，该酶在45°C、pH 7.5-8.0条件下对纤维三糖/四糖/五糖展现出高磷酸解活性(kcat/Km=1.4 mM?1·s?1)。研究者创新性地利用HoCDP催化纤维二糖与葡萄糖-1-磷酸(Glc1P)反应，在100 mL规模反应中获得纯度94.2%、终浓度11.9 g/L的纤维三糖，为高纯度功能性低聚糖的酶法合成提供了新策略。

　　

Highlight

本研究首次从极端环境微生物Halothermothrix orenii中发掘出具有独特底物特异性的纤维糊精磷酸化酶(HoCDP)，该酶在温和条件下即可高效催化纤维三糖合成，突破了传统酸解法产物混杂的技术瓶颈。

Section snippets

试剂与通用方法

纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖和纤维五糖购自Megazyme公司，葡萄糖-1-磷酸(Glc1P)及其他生化试剂均来自Sigma-Aldrich。蛋白质浓度采用考马斯亮蓝G-250法测定。

重组HoCDP的生产与功能

生物信息学分析发现H. orenii H168菌株的GH36家族蛋白含有COG3459保守结构域（GenBank登录号WP_015923692.1），经SignalP 5.0预测其不含信号肽。重组表达的HoCDP展现出对纤维三糖的特异性催化能力，在磷酸解反应(k_cat/K_m=1.4 mM^?1·s^?1)与合成反应(k_cat/K_m=1.3 mM^?1·s^?1)中具有相近的催化效率。

Conclusion

HoCDP在pH 7.0-9.0和30-50°C范围内保持高活性，通过"自下而上"的合成策略，采用分批补料Glc1P的方式，最终实现纤维三糖占产物总量94.2%的高选择性合成，为功能性寡糖的工业化生产提供了新思路。