可生物降解的Zn-0.8Mg-0.2Sr合金作为一种内固定材料，具有可控的降解性能，并能促进骨生成

《RSC Advances》：Biodegradable Zn-0.8Mg-0.2Sr alloy as an internal fixation material exhibits controlled degradation with enhanced osteogenesis

锌基生物可降解合金的腐蚀控制与骨再生协同机制研究。通过开发Zn-0.8Mg-0.2Sr三元合金，系统评估其体外腐蚀行为与细胞毒性，以及体内骨整合与免疫调节效果。研究发现该合金在低Zn2?浓度（≤8.98 μg mL?1）下显著提升骨形成相关ALP、OPN和矿化能力，其腐蚀速率仅为纯锌的30%。体内实验显示合金表面形成致密的磷酸盐保护层，促进新骨连续沉积（骨体积分数提高35%），并调控巨噬细胞向M2型极化（Arg1表达升高2.1倍）。该研究为开发兼具可控降解与骨诱导协同效应的生物固定材料提供理论依据。

　　锌及其合金在医疗应用中展现出作为可降解金属的潜力。然而，其在内部固定领域的临床应用受到机械强度不足、腐蚀控制不佳以及生物活性有限等限制。为了解决这些问题，研究者开发了一种通过挤出工艺制备的Zn-0.8Mg-0.2Sr三元合金，并对其生物性能进行了系统的评估。实验结果显示，这种合金在体外表现出优越的抗腐蚀性能，主要归因于其形成的致密钝化层，有效保护了材料表面，控制了降解速率，并减轻了锌离子的释放。此外，该合金对成骨细胞的细胞毒性表现出浓度依赖性，在锌离子浓度较低的范围内（≤8.98 μg mL?1），其促进成骨分化的能力优于纯锌。体内研究进一步证实了Zn-0.8Mg-0.2Sr良好的生物相容性，其降解更为均匀，减少了点蚀和结构塌陷的风险。值得注意的是，该合金在促进骨再生和抗炎免疫调节方面表现出优于纯锌的性能。这些发现表明，Zn-0.8Mg-0.2Sr是一种有希望的替代传统内部固定材料的选项，具备良好的生物相容性、可控的生物降解性和增强的成骨能力。

内部固定材料，也被称为骨合成植入物，广泛应用于骨骨折和畸形的外科治疗中。这些设备包括钢板、螺钉、钉子和杆，旨在提供机械支持、维持正确的骨对齐并促进愈合过程。目前，临床使用的大多数内部固定材料为不可降解金属，主要为不锈钢（316L）和钛合金（Ti）。虽然这些材料具有较高的机械强度和可接受的生物相容性，但它们通常会永久留在体内，或者需要二次手术取出，这增加了患者的负担并提高了感染风险。此外，由于缺乏生物活性，传统材料可能在促进骨愈合方面能力有限，从而增加诸如延迟愈合或不愈合等并发症的风险。

鉴于上述局限性，可降解金属（BMs）作为一种替代材料，逐渐受到关注。与传统材料不同，BMs可以被宿主逐渐吸收，使骨骼能够完全再生，而无需二次取出手术。目前，关于可降解金属的研究主要集中在镁（Mg）、铁（Fe）和锌（Zn）系统，包括它们的合金和复合衍生物。尽管Mg基合金在临床开发中最为成熟，但由于其在生理环境中快速腐蚀，可能导致机械完整性过早丧失，同时伴随氢气产生，阻碍了其临床应用。Fe基合金的腐蚀速率则过慢，可能留下不可吸收的残留物，影响骨愈合并引发长期并发症。相比之下，Zn的腐蚀行为介于Fe和Mg之间，其标准电极电位（?0.76 V）位于Fe（?0.44 V）和Mg（?2.37 V）之间。此外，Zn的降解过程中不会产生气体，并且形成的降解产物具有良好的生物相容性，能够被有效代谢。更重要的是，Zn作为必需的微量元素，参与多种细胞过程，同时作为生物活性剂刺激成骨作用。这些优势凸显了Zn在临床中的潜力，并吸引了学术界的广泛关注。

然而，纯锌并不适合直接作为骨固定材料，因为其固有的局限性。其中一个重要问题是其机械强度不足，无法为骨骼提供足够的结构支持，特别是在承重部位。此外，纯锌在体液中的氯离子环境中容易发生点蚀，这种不可控的降解可能导致材料过快损失和不规则的结构损坏，最终导致机械失效。与点蚀相关的锌离子的突发释放增加了毒性风险，可能延迟骨愈合甚至引发组织坏死。为了解决这些问题，通过与其他生物相容性元素如锶（Sr）和镁（Mg）合金化，被认为是一种有效策略，以通过微结构细化、金属间相形成和钝化调控来提高机械性能和腐蚀行为。更重要的是，这些合金元素可能诱导额外的生物功能。例如，Mg2?通过激活Wnt信号通路和刺激周围神经分泌钙钙素基因相关多肽-α（CGRP）来增强成骨作用。此外，Sr2?已被证明能够通过促进成骨细胞的增殖和分化来增强骨形成。这些合金元素的协同作用可能进一步提升材料的生物功能。

在先前的研究中，研究团队开发了一种具有优异机械性能的Zn-0.8Mg-0.2Sr三元合金，其抗拉强度为324 MPa，屈服强度为244 MPa，显微硬度为87，超过了纯锌的性能，满足了骨固定装置的要求。然而，理想的骨植入材料不仅需要足够的机械强度，还应具备良好的生物相容性、可控的生物降解性和满意的生物功能性。基于初步的实验研究，本研究旨在通过体外和体内实验，系统评估Zn-0.8Mg-0.2Sr在成骨微环境中生物性能，并进一步验证其作为可降解骨固定材料的可行性。

材料的制备基于先前的方法，简要过程包括在520°C下熔炼高纯度的锌、镁和锶元素，并持续搅拌20分钟，随后铸造、退火和水淬处理。最终获得的均匀锭材被加工成圆柱形和圆盘形，分别用于体内植入和体外研究。纯锌样品（由 Zhong Ke Yan Nuo 新材料有限公司提供）以相同尺寸作为对照。所有样品在生物评估前均经过表面研磨、超声波清洗和紫外线灭菌处理。

通过扫描电子显微镜（SEM）结合能谱分析（EDS）和电子背散射衍射系统（EBSD）对Zn-0.8Mg-0.2Sr的微观结构进行了表征。该合金由锌基体和等轴再结晶晶粒组成，晶粒尺寸约为2.5 μm，这是热加工材料的典型特征。此外，金属间颗粒沿着挤压方向排列，主要由Mg?Zn??和SrZn??组成，这是由于镁和锶的含量超过了其在锌中的溶解度极限。在名义成分下，这两种金属间相在热力学上是稳定的，并且符合所选二元相图的预期。逆极图和逆极图显示了特征性纹理，锌的基面几乎平行于挤压方向，这是挤出锌基材料的典型特征，源于基面和二次阶金字塔 + 滑移的共同作用。

体外腐蚀测试显示，Zn-0.8Mg-0.2Sr表现出更均匀的腐蚀行为。在不同的表面体积比（S/V）下进行72小时的静态浸泡测试。较低的S/V比（0.25 cm2 mL?1）与电化学腐蚀测试相同，而较高的S/V比（1 cm2 mL?1）则用于模拟骨植入区域有限的离子交换。在较低的S/V比下，Zn-0.8Mg-0.2Sr组检测到的Zn2?浓度为28.75 ± 0.57 μg mL?1，约为纯锌组检测值的28%。基于这些数值，计算出在均匀溶解条件下的腐蚀速率为20 μm·a?1。在较高的S/V比下，Zn2?浓度显著增加至36.3 μg mL?1（p = 0.015）。视觉评估显示，Zn-0.8Mg-0.2Sr呈现出更灰暗的外观，但仍保持金属光泽。所有材料表面均观察到白色纤维状沉积物，其在SEM下的BSE强度较低。与纯锌相比，这些沉积物在Zn-0.8Mg-0.2Sr上出现更频繁且颗粒更小。Zn-0.8Mg-0.2Sr的腐蚀产物主要由C和O组成，伴随少量的Zn、P和Ca，而纯锌的腐蚀产物则主要由Zn、P、O和Cl组成。此外，Zn-0.8Mg-0.2Sr的P/Zn和O/Zn比值高于纯锌，表明其腐蚀产物中磷和氧的含量更高。通过去除纤维状沉积物后的腐蚀产物分析，发现Zn-0.8Mg-0.2Sr的腐蚀产物中含有更多的P，以及一定量的Cl和S。这些沉积物可能由蛋白质和无机离子的二次矿化形成。这些结果表明，Zn-0.8Mg-0.2Sr的腐蚀行为受到其表面有机沉积物的调控，从而限制了局部锌离子的浓度，防止了材料的过早降解。

为了评估腐蚀动力学，研究了开路电位（E_OC）和极化电阻（R_P）的变化趋势。Zn-0.8Mg-0.2Sr组在前12小时内表现出显著的R_P增加，表明形成了腐蚀抑制层。随后进入稳定阶段，R_P在接下来的20小时内保持在约4 Ω m2的水平。纯锌组在前6小时内表现出相似的初始趋势，但随后腐蚀速率加快，峰值出现在12小时后，之后逐渐减缓，稳定在约3 Ω m2。这些R_P趋势与E_OC的演变趋势一致。纯锌的E_OC表现出更快的初始增加，并达到较高的峰值电位（?0.93 V per SSCE，即?0.72 mV per SHE）。在12小时后，两种材料的E_OC稳定在?0.96至?0.97 V per SSCE（即?0.75至?0.76 V per SHE）。极化曲线进一步支持了钝化层的形成。对于合金，其阳极线性区域的Tafel斜率（186 mV dec?1）表明其在腐蚀电位以上的性能，而纯锌的Tafel斜率则显示其腐蚀速率更高。这些数据结合阻抗分析，表明Zn-0.8Mg-0.2Sr的腐蚀主要发生在金属间相，导致更均匀的局部腐蚀。此外，表面形成的富含有机物的沉积物可能调节局部金属离子浓度，促进不溶性产物（如锌磷酸盐和镁磷酸盐）的沉淀，从而限制了腐蚀速率。

在评估Zn-0.8Mg-0.2Sr的细胞毒性时，发现其表现出剂量依赖性。锌离子、镁离子和锶离子在空白培养基、纯锌提取物和Zn-0.8Mg-0.2Sr提取物中的浓度显示，纯锌提取物中的锌离子浓度显著高于空白培养基（97.03 ± 17.93 μg mL?1 vs. 0.24 ± 0.01 μg mL?1），而Zn-0.8Mg-0.2Sr提取物中的锌离子浓度显著低于纯锌（35.20 ± 0.60 μg mL?1 vs. 97.03 ± 17.93 μg mL?1）。为了进行有效的生物效应比较，将纯锌和Zn-0.8Mg-0.2Sr提取物的锌离子浓度标准化为相同的值（35.2 μg mL?1），然后将其进行不同稀释度（100%、50%、25%、10%和5%）的细胞实验。CCK-8实验结果表明，100%和50%的提取物显著降低了MC3T3-E1细胞的活性，对应ISO标准中的4级细胞毒性。相比之下，25%的提取物对细胞活性没有显著影响，且细胞形态良好。细胞形态观察和活/死染色实验进一步支持了这一结论：在25%的提取物中，MC3T3-E1细胞保持了良好的活性和形态，而100%和50%的提取物则导致细胞死亡和形态改变。这些结果表明，Zn-0.8Mg-0.2Sr在非毒性浓度范围内（≤8.98 μg mL?1）对成骨细胞具有促进作用，且其促进效果优于纯锌。这种增强的生物效应可能归因于Zn-0.8Mg-0.2Sr提取物中较高水平的Mg2?和Sr2?，它们通过激活Wnt信号通路和促进成骨细胞的分化和基质矿化，协同促进成骨作用。

在体内实验中，Zn-0.8Mg-0.2Sr表现出良好的生物相容性。研究通过将纯锌和Zn-0.8Mg-0.2Sr棒植入大鼠胫骨近端，观察其28天后的系统毒性。手术后，手术部位恢复良好，无感染、出血或组织坏死的迹象。植入28天后，Zn-0.8Mg-0.2Sr周围形成了健康的骨组织，并被致密的骨膜覆盖。主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）的组织学分析未发现形态异常或炎症浸润。此外，植入28天后，实验组与假手术组在血液中的Zn2?、Mg2?和Sr2?浓度没有显著差异。这些结果表明，尽管纯锌和Zn-0.8Mg-0.2Sr在体外表现出细胞毒性，但它们在体内均显示出良好的生物相容性。体外和体内结果的差异可能源于以下因素：（1）本研究的细胞毒性评估遵循ISO标准，最初是为不可降解材料设计的；（2）标准化的体外实验未能模拟体内生理代谢和清除过程，使降解产物和释放的金属离子能够迅速进入全身循环并被再利用或通过粪便和尿液排出。因此，体内实验结果更能反映材料的真实生物相容性。

在体内实验中，Zn-0.8Mg-0.2Sr表现出可控的降解行为。通过立体显微镜观察植入胫骨近端的纯锌和Zn-0.8Mg-0.2Sr样品，发现Zn-0.8Mg-0.2Sr的表面形成了相对均匀的降解产物，并与周围结缔组织紧密结合，而纯锌的表面则大部分暴露于金属。为了更深入地了解降解产物，对骨-植入物界面的横截面进行了电子探针微分析（EPMA-WDS）检测。结果显示，纯锌的边缘部分仍保持其原始曲率，但在某些区域观察到了点蚀（绿色箭头）和结构塌陷（蓝色箭头），其腐蚀深度在40至88 μm之间。相比之下，Zn-0.8Mg-0.2Sr的腐蚀模式更为均匀，边缘呈现出一致的锯齿状，并未观察到点蚀或结构塌陷。此外，分析表明，Zn-0.8Mg-0.2Sr周围释放的Zn量较少，新形成的骨组织与植入物保持相对较远的距离。这表明，Zn-0.8Mg-0.2Sr的降解产物可能促进新骨的形成，其丰富的磷含量可能通过其优异的生物相容性和生物活性，促进细胞附着和组织整合。

为了进一步评估Zn和Zn-0.8Mg-0.2Sr对成骨作用和免疫反应的影响，研究使用qRT-PCR检测了相关基因的表达水平。免疫组织化学分析显示，纯锌和Zn-0.8Mg-0.2Sr组中，CD68阳性细胞（全巨噬细胞）和iNOS阳性细胞（M1巨噬细胞）的数量没有显著差异。然而，Zn-0.8Mg-0.2Sr组中CD163阳性细胞（M2巨噬细胞）的数量显著增加，这可能源于M1向M2的转化或M0巨噬细胞的直接激活。这一发现表明，Zn-0.8Mg-0.2Sr植入物具有优越的免疫调节性能，能够促进有利于骨愈合和组织再生的免疫微环境。此外，Zn、Mg和Sr均被报道能够促进M2巨噬细胞的极化。因此，Zn2?、Mg2?和Sr2?的协同作用可能通过促进更平衡的炎症反应，增强Zn-0.8Mg-0.2Sr合金的免疫调节能力。

为了更全面地评估Zn和Zn-0.8Mg-0.2Sr对巨噬细胞极化和成骨分化的影响，研究检测了NOS2、ARG1、RUNX2、ALPL和BMP2等基因的相对表达水平。结果与免疫组织化学发现一致，纯锌和Zn-0.8Mg-0.2Sr组中M1巨噬细胞标记基因（NOS2）的表达水平与假手术组无显著差异。然而，M2巨噬细胞标记基因（ARG1）的表达在纯锌和Zn-0.8Mg-0.2Sr组中显著上调。为了进一步理解这些基因表达的变化，研究绘制了M0、M1和M2巨噬细胞及其对应标记的动态变化图。成骨相关基因（RUNX2、ALPL和BMP2）的表达水平在纯锌和Zn-0.8Mg-0.2Sr组中均上调，但两者之间没有显著差异，尽管Zn-0.8Mg-0.2Sr组的RUNX2和BMP2表达水平略高。这可能与研究的局限性有关：为了获得足够的RNA用于检测，需要更大的骨组织样本，包括植入物周围的骨组织和部分远端骨组织，这可能降低了基因表达差异的分辨率。为了解决这一问题，未来的研究可以采用微解剖技术和单细胞RNA测序，以精确定位植入物周围的基因表达，从而更深入地理解离子相互作用和生物机制。

总之，Zn-0.8Mg-0.2Sr三元合金表现出可控且均匀的降解动力学，由致密且富含磷的钝化层介导，有效抑制了点蚀和结构塌陷。在非细胞毒性阈值（Zn2? ≤8.98 μg mL?1）范围内，Zn-0.8Mg-0.2Sr提取物能够有效促进成骨作用，这得益于Zn2?、Mg2?和Sr2?的协同效应。更重要的是，Zn-0.8Mg-0.2Sr在体内表现出良好的生物相容性和生物功能，能够促进抗炎免疫调节、骨再生和骨重塑。这些发现表明，Zn-0.8Mg-0.2Sr是一种有希望的替代传统内部固定材料的选项，适用于骨科应用。