tRNA阵列法实现21种转移RNA的体外同步表达——迈向自复制人工细胞的关键突破

研究人员针对人工细胞构建中tRNA同步合成的难题，开发了tRNA阵列法，通过组合HDVR核酶与RNase P处理策略，首次在PURE系统中实现21种tRNAs从单条多顺反子DNA模板的同步表达，其翻译活性达到常规IVS tRNA混合物的水平。该成果为构建自复制人工细胞提供了关键技术支持，同时为遗传密码工程提供了简便的tRNA制备方案。

　　

在构建人工生命的宏伟蓝图中，实现遗传信息传递系统的自我复制是至关重要的一环。作为翻译过程中的关键元件，转移RNA(tRNA)需要至少21种才能完成所有氨基酸的转运。然而，在体外重建这一系统面临巨大挑战——天然tRNA的5'和3'端加工需要复杂的多步酶促反应，而现有技术难以实现多种tRNAs的同步表达。Ryota Miyachi等研究团队在《Nature Communications》发表的这项研究，通过创新的tRNA阵列法，成功突破了这一技术瓶颈。

研究团队首先建立了无tRNA污染的PURE系统(tfPURE system)，通过优化核糖体和EF-Tu的纯化方法，消除了背景翻译干扰。针对5'端加工难题，他们比较了两种策略：引导序列法（添加可被RNase P切除的5'引导序列）和5'-G变异法（将起始碱基突变为G）。实验显示，除tRNA^Asn外，5'-G变异体普遍表现出更高的翻译活性。对于3'端加工，团队开发了HDVR自剪切核酶法和tRNA直接连接法，发现组合使用这两种方法（命名为tRNA阵列法）可同时解决5'和3'端加工问题。

关键技术包括：(1)建立tRNA-free PURE系统；(2)优化RNase P(M1 RNA+C5蛋白)处理条件；(3)设计多顺反子tRNA阵列模板；(4)开发基于纳米孔测序的tRNA组成分析方法；(5)应用HiBiT系统进行蛋白质定量。所有实验均使用实验室制备的翻译组件和体外转录的RNA。

研究结果显示：

1. 1.

   单顺反子表达：通过引导序列法或5'-G变异法，六种非G起始tRNAs在tfPURE系统中成功表达，荧光素酶活性达10⁷RLU水平。

2. 2.

   多顺反子表达：将21种tRNAs分为5个操作子（如IPEN、GARCQ等阵列），通过tRNA阵列法实现各组tRNAs的功能性表达，其中添加C5蛋白可显著提高RNase P对长阵列的切割效率。

3. 3.

   全系统整合：单条多顺反子DNA模板编码全部21种tRNAs，经转录后处理产生的tRNA混合物支持荧光素酶翻译活性达4.7×10⁶RLU，相当于常规IVS tRNA混合物的59%。

4. 4.

   应用验证：该方法制备的tRNA组成功实现了遗传密码重编程，将Nanoluc中五个Leu密码子(CUU)重新分配为ACG(Thr)，并通过工程化tRNA^Leu_CGU恢复活性。

讨论部分指出，该研究首次在PURE系统中实现了全部必需tRNAs的同步表达，相比天然系统中复杂的加工过程（涉及RNase E、PH、D等多重酶系），tRNA阵列法提供了更简洁高效的解决方案。虽然表达tRNAs缺乏转录后修饰导致翻译效率约为天然tRNAs的46%，但该方法已满足人工细胞构建的基本需求。作者特别强调，该技术不仅为自复制系统的实现铺平了道路，其简便的体外转录方案更为遗传密码工程提供了新工具——通过单次反应即可获得全套最小tRNA组，极大简化了非天然氨基酸掺入等应用的实验流程。

这项研究标志着合成生物学领域的重要进展，通过巧妙组合已知的RNA加工机制，解决了人工生命系统构建中的关键瓶颈问题。未来通过优化tRNA阵列排列顺序、引入修饰酶系统等方法，有望进一步提升翻译效率，最终实现完全自维持的人工遗传信息传递系统。