RENDER平台：基于病毒样颗粒递送CRISPR表观基因组编辑核糖核蛋白的突破性技术

本研究针对CRISPR表观基因组编辑器(如CRISPRoff)因体积过大导致的递送难题，开发了RENDER（Robust ENveloped Delivery of Epigenome-editor Ribonucleoproteins）平台。通过工程化病毒样颗粒(eVLPs)成功实现了CRISPRi、DNMT3A-3L-dCas9和CRISPRoff等表观编辑器的瞬时递送，在多种人类细胞（包括原代T细胞和iPSC来源神经元）中实现持久基因沉默（如Tau蛋白降低63%）。该技术克服了AAV载体容量限制和mRNA电转毒性问题，为神经退行性疾病治疗提供了新策略。

　　

在基因治疗领域，表观基因组编辑技术因其不改变DNA序列的特性备受关注。然而，传统CRISPR-based表观编辑器如CRISPRoff（约7.2kb）因体积庞大难以通过AAV载体递送，而mRNA电转又存在细胞毒性问题。更棘手的是，神经元等难转染细胞对现有递送技术响应不佳，这严重阻碍了其在神经退行性疾病治疗中的应用。如何实现高效、安全的表观编辑器递送，成为制约该技术临床转化的关键瓶颈。

针对这一挑战，Da Xu、Swen Besselink等研究者开发了RENDER递送平台。该研究主要采用四大关键技术：(1)工程化病毒样颗粒(eVLPs)包装系统，通过优化gag-CRISPRoff与gag-pol比例(90:10)提升装载效率；(2)多细胞类型验证体系，涵盖HEK293T、Jurkat等8种细胞系及原代T细胞；(3)全基因组DNA甲基化测序(WGEM-seq)和RNA-seq评估编辑特异性；(4)iPSC-derived神经元模型，靶向MAPT基因V337M突变体评估Tau蛋白沉默效果。

eVLPs enable delivery of various epigenome editor RNP into human cells

研究团队首先改造BE-eVLP系统，将碱基编辑器替换为CRISPRi、DNMT3A-3L-dCas9和CRISPRoff等表观编辑器。通过ELISA和Western blot证实CRISPRoff-eVLPs成功包装（图1c,d），在HEK293T-CLTA-GFP报告系统中实现最高92%的基因沉默（图1f）。值得注意的是，采用ZIM3 KRAB结构域比传统KOXI KRAB沉默效果提升3.9倍。

Rational optimization of RENDER-CRISPRoff

通过系统优化发现：提高gag-CRISPRoff比例至90%时沉默效率最佳（图2d）；增加sgRNA质粒量可进一步提升编辑效率（图2e）。最终获得的RENDER-CRISPRoff v3版本在HEK293T细胞中实现持续49天的基因沉默（图2g），在H2B-GFP模型中沉默效率达99%（图2i）。

RENDER-CRISPRoff editing across various human cell types

平台在8种细胞系中展现广泛适用性：在Jurkat细胞中CD55沉默效率>80%，U87 MG细胞中CD81沉默效率>82%（图3a）。WGEM-seq显示CD55启动子区甲基化显著增加（图3b,c），RNA-seq证实编辑高度特异（图3d,e）。通过共包装多sgRNA，成功实现Jurkat细胞中CD55/CD81双基因沉默（46%）（图3g）。

Epigenome editing in primary human T cells with minimal effect on cell viability

相比mRNA电转（存活率58%），RENDER处理的原代T细胞存活率达91%（图4b,c）。CD55沉默效率在11天后仍保持稳定（图4d），为CAR-T细胞改造提供了新选择。

Therapeutic epigenome editing in iPSC-derived neurons

在iPSC-derived神经元中，单次RENDER处理即可实现CD81持久沉默（79%）（图5b,c）。靶向MAPT V337M突变体时，Tau蛋白水平降低63%（图5d,e），为tauopathies治疗提供了潜在方案。

这项研究通过RENDER平台实现了三大突破：首先，解决了大分子量表观编辑器的递送难题，eVLPs装载效率较传统方法提升4.4倍；其次，首次证明CRISPRoff-RNP可在神经元中建立持久表观沉默；最后，为原代细胞编辑提供了高存活率方案。该技术不仅克服了AAV载体容量限制，其瞬时特性还显著降低了脱靶风险。特别值得注意的是，在MAPT V337M突变神经元中实现的Tau蛋白抑制，为阿尔茨海默病等tauopathies的"一次治疗、长期有效"提供了新思路。研究者建议未来可结合组织特异性包膜蛋白，进一步拓展其在体内编辑的应用前景。