新生肝脏蛋白质组揭示生理与酒精暴露条件下的关键酶与转录调控因子

这项研究通过开发SORT-AC技术，成功在活体小鼠肝脏中实现了新生蛋白质组的特异性标记与膜蛋白富集。研究人员利用乙醇诱导的肝损伤模型，鉴定出包括Phb1/2转录共调节因子和Acsl1/5脂肪代谢酶在内的关键调控蛋白，揭示了酒精代谢的分子机制，为酒精相关性肝病(ALD)的治疗提供了新靶点。该技术为研究肝脏病理生理动态变化提供了有力工具。

　　

肝脏作为人体最大的代谢器官，承担着数百种重要的生物学功能。然而，在酒精暴露条件下，肝脏蛋白质组的失调会导致酒精相关性肝病(ALD)，这已成为全球性的重大健康挑战。尽管质谱(MS)为基础的蛋白质组学已揭示了人类肝脏蛋白质组的细胞学特征，但仍缺乏在活体动物中获取肝脏特异性蛋白质组数据的方法，这限制了对肝脏在各种病理生理条件下分子调控机制的理解。

传统蛋白质组分析主要关注稳态蛋白质组，而新生蛋白质组分析因其能够及时识别动态变化的关键调控蛋白而备受关注。虽然已有多种方法可用于选择性分析培养细胞中新合成的蛋白质，但除了随机正交翻译重编码(SORT)和生物正交非经典氨基酸标记(BONCAT)策略外，大多数方法无法用于活体动物特定组织的新生蛋白质组研究。肝脏作为代谢最复杂的器官，其新生蛋白质组标记面临巨大挑战：代谢复杂性、大量预先存在蛋白质的污染干扰，以及缺乏特异高效的标记方法。在疾病动物模型(如乙醇诱导的肝损伤小鼠模型)中，标记时机的选择和病变组织的可及性更为困难。

针对这些问题，Jiayu Gu、Lihui Lao等研究人员在《Nature Communications》发表了题为"Nascent liver proteome reveals enzymes and transcription regulators under physiological and alcohol exposure conditions"的研究论文。他们开发了随机正交翻译重编码由AAV递送的Cre诱导系统(SORT-AC)，该系统能优先富集肝脏膜蛋白，适用于分析各种病理生理条件下新生肝脏蛋白质组的急性细微变化，无需组织解剖。当应用于乙醇诱导的肝损伤小鼠模型时，SORT-AC成功鉴定并验证了与酒精代谢相关的几乎所有已知调控蛋白和通路，包括参与肝脂肪变性分子调控的多个转录调节因子、酶和保护性分子伴侣。研究发现Phb1/2是乙醇代谢过程中的重要转录共调节因子，而鉴定的脂肪酸代谢酶Acsl1/5的抑制可保护细胞和小鼠免受脂质积累的影响，这是肝脂肪变性的关键症状。

研究采用了几个关键技术方法：1)开发了SORT-AC系统，结合CRISPR-Cas9敲入小鼠模型和AAV递送的Cre重组酶，实现肝脏特异性新生蛋白质组标记；2)优化了吡咯赖氨酰-tRNA合成酶/吡咯赖氨酰-tRNA(PylRS/PylT)对，提高非经典氨基酸AlkK的掺入效率；3)建立了乙醇诱导肝损伤小鼠模型，通过间歇灌胃和饮水方式模拟急慢性酒精吸收模式；4)优化肝脏组织点击化学反应条件，克服肝脏复杂生化环境对标记效率的影响；5)采用LC-MS/MS分析技术对富集的新生蛋白质组进行鉴定和定量。

研究结果部分主要包括：

"Labeling the nascent proteome, including membrane proteins"：研究人员筛选出对AlkK识别效率最高的PylRS变体1(Y384F突变)，其琥珀密码子通读效率约为野生型GFP的50%。通过工程化改造AlkKRS/4xPylT_CUA对，显著提高了掺入效率。基于氨基酸分布特征，选择了K、A、S和M作为AlkK掺入的靶标残基，组合使用PyIT_KASM实现了对总蛋白和膜蛋白的高效标记。

"Identification of liver-specific nascent proteome in living mice"：通过CRISPR-Cas9将loxP侧翼终止序列敲入H11位点，构建了SORT_KASM小鼠模型。注射AAV-TTR-Cre后，Cre重组酶切除终止序列，使AlkKRS在肝组织中表达。通过饮水方式给予AlkK，SORT_KASM系统识别AlkK并将其随机掺入新合成的肝脏蛋白中。优化后的点击反应条件(0.5 mM CuSO₄和1.0 mM BTTAA反应2小时)显著提高了标记效率。

"Defining the liver-specific nascent proteome of ethanol-induced liver injury mouse model by SORT-AC"：应用SORT-AC鉴定了酒精暴露条件下的新生蛋白质组。通过间歇灌胃(4 g/kg)和饮水(5%乙醇)方式建立模型，27天后收集样本。油红O染色显示肝脏组织中有大量脂质积累区域。LC-MS/MS分析鉴定出187个在酒精相关脂肪变性发生过程中特异性高表达和合成的蛋白质(EtOH Enrich)，这些新生蛋白质组与单羧酸代谢过程、生物氧化和细胞醛代谢过程高度相关。

"Validating key regulators and enzymes involved in alcohol-induced lipid accumulation"：验证了Phb1/2作为与酒精代谢相关的转录共调节因子，过表达Phb1或Phb2可显著上调Adh1、Aldh3a2、Hspa5和Acsl1/5等下游基因的mRNA水平。发现Acsl1/5抑制剂Triacsin C(IC₅₀≈15 nM)能减轻乙醇诱导的脂质积累，在AML12细胞和小鼠模型中均显示出保护作用。急性酒精灌胃小鼠模型中使用Triacsin C治疗后，血清AST水平显著降低，肝脏脂质积累减少。

研究结论指出，SORT-AC技术将化学生物学工具与遗传模型相结合，能够分析活体小鼠肝脏新生蛋白质组的急性细微变化。该技术通过随机重编码K、A、S和M残基，实现了新生膜蛋白质组的高效富集，适用于各种生理和病理条件下动态肝脏蛋白质组的定量分析。在乙醇诱导的肝损伤小鼠模型中，SORT-AC鉴定出了几乎所有已知的与酒精代谢相关的调控蛋白和通路，大大扩展了酒精代谢相关蛋白和通路的信息量，特别是新发现的膜相关蛋白质组。

这项研究的创新性在于：1)开发了能够在活体动物肝脏中特异性标记新生蛋白质组的技术；2)实现了膜蛋白质组的高效富集；3)发现了低丰度转录因子Phb1/2在酒精代谢中的调控作用；4)验证了Acsl1/5作为减轻酒精诱导肝损伤的潜在治疗靶点。SORT-AC技术为研究肝脏在各种疾病模型中的分子机制提供了新工具，有望促进更多低丰度调控因子和治疗靶点的发现。该研究不仅增进了对酒精性肝病发病机制的理解，也为开发新的治疗策略提供了重要线索。