FlexTORCH：一种改进型柔性荧光团-连接体-淬灭剂分子为ADC研究提供新工具

研究人员针对抗体-药物偶联物(ADC)研究中内化动力学分析难题，开发了新型flexTORCH分子。该工具通过正交点击化学实现模块化组装，成功构建含VC-PABC、??-glucuronide-PABC等蛋白酶识别结构的四种变体，为ADC的cathepsin B、legumain等靶点释放机制研究提供灵活解决方案。

　　

在肿瘤治疗领域，抗体-药物偶联物(antibody-drug conjugates, ADC)正展现出革命性的潜力。这类"生物导弹"通过抗体精准导航，将细胞毒性药物递送至肿瘤部位。然而，ADC的疗效高度依赖于三大关键步骤：抗体内化效率、连接体(linker)切割精度以及载荷(payload)释放动力学。其中，可被溶酶体蛋白酶cathepsin B识别的valin–citrullin(VC)连接体是临床常用设计，但现有研究工具难以动态监测这一复杂过程。

研究团队此前开发的TORCH(Turn On after Release by Cathepsin)分子虽能通过荧光激活反映蛋白酶切割过程，但其刚性结构导致合成困难、设计灵活性不足。为此，Tim Neumann等人在《Bioconjugate Chemistry》发表研究，报道了改进型flexTORCH系统。这个创新平台如同"分子乐高"，通过正交点击化学实现荧光团、连接体-淬灭剂模块的自由组合，为ADC研发人员提供了前所未有的研究工具。

关键技术包括：1) 模块化分子设计，采用点击化学修饰的荧光团(fluorophore)与连接体-淬灭剂(linker-quencher)组件；2) 构建四种蛋白酶敏感连接体(VC-PABC、??-glucuronide-PABC、AAN-PABC及AAN)；3) 逐步偶联技术将flexTORCH与曲妥珠单抗(trastuzumab)结合；4) 体外验证系统评估不同构造的切割激活特性。

研究结果显示：

分子设计与合成

成功开发基于二苯基环辛炔(DBCO)与叠氮化物的点击化学平台，使荧光团(如Cy5)与不同连接体-淬灭剂模块实现高效偶联。其中VC-PABC模块保持经典cathepsin B识别序列，而新型??-glucuronide-PABC模块则针对肿瘤微环境高表达的??-葡萄糖醛酸酶设计。

功能验证

体外实验证实，所有flexTORCH变体均能响应相应蛋白酶产生荧光信号。特别值得注意的是，AAN连接体(legumain识别序列)展现出优于传统设计的切割效率，这为开发新型legumain响应型ADC提供了直接证据。

抗体偶联应用

通过分步偶联策略，成功将flexTORCH分子定点修饰到曲妥珠单抗上。质谱分析显示，每个抗体平均偶联3-4个flexTORCH分子，且不影响抗体与HER2受体的结合能力。

讨论部分强调，flexTORCH的创新性体现在三大维度：首先，模块化设计突破传统合成限制，使研究人员能快速构建含不同蛋白酶响应元件的探针；其次，正交偶联策略为ADC的位点特异性标记提供新方法；最重要的是，该系统首次实现单平台上比较不同连接体的切割动力学，这对优化ADC设计具有指导意义。

这项研究不仅解决了ADC研发中的关键分析难题，其灵活的设计理念更可能扩展到其他靶向递送系统研究。正如作者指出，未来可通过替换荧光团/淬灭剂对、增加新的蛋白酶识别模块，使flexTORCH成为"一站式"的递送系统评估平台。该成果为精准肿瘤治疗工具的研发树立了新标杆。