好氧烯烃代谢菌Mycolicibacterium sp. ELW1中异丁烯环氧化物水解酶(IbcK)的功能与结构表征

这篇研究首次系统解析了异丁烯(IB)降解菌Mycolicibacterium sp. ELW1中关键酶IbcK的催化机制。该酶属于α/β水解酶家族，能特异性将异丁烯环氧化物(IBO)水解为2-甲基-1,2-丙二醇(MPD)，比活达29 μmol·min-1·mg-1。晶体结构显示其活性中心由Asp117-Asp256-His284构成，并通过"帽"结构域形成单体-二聚体动态平衡。该发现为理解微生物降解挥发性烯烃的代谢途径提供了新视角。

　　

引言

好氧细菌对挥发性烯烃（如乙烯、丙烯和异戊二烯）的代谢已有深入研究，这些微生物通过单加氧酶催化C=C键的初始氧化生成环氧化物。然而，环氧化物后续代谢途径的多样性仍待探索。Mycolicibacterium sp. ELW1是首个被报道能以异丁烯(IB)为唯一碳源和能源的细菌，其代谢途径中关键的异丁烯环氧化物(IBO)水解机制尚未阐明。

结果与讨论

关键酶IbcK的鉴定

通过基因组分析，在ELW1的222 kbp大质粒上发现了一个与IB代谢相关的基因簇，其中ibcK基因编码的蛋白与Agrobacterium radiobacter AD1的环氧化物水解酶EchA具有高度相似性。系统发育分析显示，IbcK与近期发现的IB降解菌M. gadium IBE100和M. paragordonae IBE200中的同源酶形成独立分支。

酶学特性

重组表达的IbcK能高效催化IBO水解，30分钟内将1.5 mM IBO完全转化为MPD，质量平衡比达0.91。其比活为29 μmol·min^-1·mg^-1，Km值≤200 μM。底物谱分析显示，该酶对C₃-C₅直链环氧化物（1,2-环氧丙烷至1,2-环氧戊烷）也有较弱活性，但对非末端环氧化物如顺/反-2,3-环氧丁烷的催化效率显著降低。值得注意的是，IbcK表现出明显的对映选择性——仅能完全转化非手性的顺式-2,3-环氧丁烷，而对反式异构体的水解在60分钟后停滞在45%转化率。

结构生物学突破

2.29 ?分辨率的晶体结构揭示了IbcK的独特构象：

1. 1.

   核心结构域：采用经典α/β水解酶折叠，包含8条β链和连接α螺旋

2. 2.

   活性中心：由"亲核肘"（β5-α3环）上的Asp117、β7后的Asp256和β8后的His284组成催化三联体

3. 3.

   二聚化界面：通过α5-α6螺旋间的疏水相互作用（Val156/Trp161/Phe165/Met170）形成6,120 ?²的接触面，溶液色谱证实存在单体-二聚体动态平衡

4. 4.

   底物通道：活性口袋被甘油分子（模拟产物MPD）占据，Tyr162/Tyr225通过氢键稳定产物，狭窄的通道解释了其对大体积环氧化物的低效催化

生物学意义

不同于常见的辅酶M(CoM)或谷胱甘肽(GSH)偶联机制，ELW1通过水解酶直接降解IBO的创新途径，为微生物适应石化污染物提供了新范例。IbcK的对映选择性特征使其在生物催化领域具有应用潜力，而其与致病菌M. tuberculosis中水解酶的结构相似性，也为抗结核药物靶点开发提供了线索。

材料与方法

研究采用分子克隆技术将ibcK基因导入pET28a(+)载体，在E. coli BL21(DE3)中表达后，通过镍柱亲和层析和分子筛获得纯度>90%的蛋白。酶活测定采用顶空气相色谱法监测环氧化物消耗。晶体生长采用1.6 M MgSO₄/0.1 M MES(pH6.5)条件，数据收集于APS同步辐射光源。

这项研究不仅解析了IB代谢的关键酶学机制，更揭示了α/β水解酶家族在环境微生物适应性进化中的重要作用。