猪源抗病毒蛋白sIFITM1、sIFITM3与sViperin作为灭活CSFV疫苗佐剂的免疫增强作用研究

本文创新性地将干扰素刺激基因（ISGs）家族成员——猪源IFITM1、IFITM3和Viperin（sIFITM1/sIFITM3/sViperin）重组蛋白开发为疫苗佐剂，通过大肠杆菌表达系统成功制备高纯度融合蛋白。研究证实三者不仅能显著抑制伪狂犬病毒（PRV）和猪流感病毒（H3N2）的复制，与经典猪瘟病毒（CSFV）灭活疫苗联用时，可协同增强小鼠体液免疫（提升IgG和E2抗体水平）和细胞免疫（促进脾T淋巴细胞增殖及IL-5/IL-28/IL-6分泌），为新型动物疫苗佐剂研发提供重要理论依据。

　　

1 引言

佐剂作为疫苗研发的核心组分，能通过非特异性增强宿主对抗原的免疫应答，弥补灭活疫苗、亚单位疫苗等低免疫原性制剂的缺陷。近年来，干扰素刺激基因（ISGs）家族因其广谱抗病毒特性备受关注，其中跨膜蛋白IFITM1/IFITM3可通过改变膜脂质流动性抑制病毒膜融合，而Viperin则通过代谢调控直接干扰病毒复制。然而，这些蛋白作为疫苗佐剂的潜力尚未被系统探索。

2 材料与方法

研究团队从猪肾细胞PK-15中克隆出sIFITM1（393bp）、sIFITM3（456bp）和sViperin（1,107bp）基因，利用pCold-TF载体在大肠杆菌中表达带触发因子（TF）伴侣的融合蛋白。通过镍柱亲和层析和硫酸铵沉淀双重纯化策略，获得纯度超92%的蛋白产物（sIFITM1 66kDa、sIFITM3 69kDa、sViperin 93kDa），内毒素含量均低于1.2 EU/mL。采用PRV感染猪源（PK-15/3D4/21）和小鼠源（NIH/3T3/C57/B6-L）细胞模型评估抗病毒活性，并通过CSFV E2重组杆状病毒灭活疫苗小鼠免疫实验验证佐剂效果。

3 结果

3.1 蛋白表达与特性分析

低温诱导表达（16°C, 0.1mM IPTG）显著提高可溶性蛋白产量。硫酸铵沉淀法优化显示：70%饱和度对sIFITM1/sViperin、60%对sIFITM3纯化效果最佳。高效液相色谱（HPLC）证实sViperin纯度高达96.9%，产量达48.16mg/L，远超传统镍柱法。

3.2 抗病毒机制

在PRV感染的PK-15细胞中，100ng/mL sViperin使病毒gE mRNA降低80%（p<0.01），显著优于sIFITM1/3。其机制与激活IFN-β/IL-28信号通路相关——sViperin处理组IL-6 mRNA水平提升4.5倍（p<0.001）。值得注意的是，sIFITM3能跨物种抑制小鼠C57/B6-L细胞中PRV-gE蛋白表达（Western blot验证），揭示其保守作用机制。

3.3 佐剂效能

与单独疫苗组相比，sViperin佐剂组呈现三大优势：

1. 1.

   免疫器官活化：脾系数增加37%（p<0.01），HE染色显示红白髓界限清晰且无病理损伤；

2. 2.

   细胞免疫增强：ConA刺激后脾T淋巴细胞增殖指数达疫苗组的2.3倍（p<0.001）；

3. 3.

   体液免疫突破：血清IgG和CSFV E2抗体OD₄₅₀值分别提高2.1倍和1.8倍，同时Th2型细胞因子IL-5分泌量增加3倍。

4 讨论

该研究首次将ISGs的抗病毒功能与免疫佐剂特性相结合。sViperin通过双重机制发挥作用：一方面其代谢产物ddhCTP直接抑制病毒RNA合成，另一方面通过激活IL-28/IL-6通路协调Th1/Th2平衡。相比传统铝佐剂，这类蛋白佐剂能同时激发细胞和体液免疫，且安全性良好（小鼠体重曲线平稳，脏器无炎性浸润）。

5 结论

研究成功建立ISGs融合蛋白的低成本规模化制备工艺，并证实sIFITM1/3和sViperin可作为高效CSFV疫苗佐剂。特别是sViperin展现的"抗病毒-免疫调节"双功能，为新型人兽共患病疫苗设计提供全新策略。未来需进一步解析其分子机制并开展猪体实验验证。