基于BAC系统构建EGFP标记的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光报告株及抗病毒药物筛选平台

本研究创新性地利用细菌人工染色体（BAC）系统构建了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）L251株的反向遗传学平台，通过优化转录调控序列（TRS6）在ORF4-5a间隔区稳定插入增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因，成功获得遗传稳定性达10代以上的荧光报告病毒rL251-ORF4-5a-EGFP。该研究不仅证实ORF4-5a是外源基因插入的理想位点，更建立了可视化高通量抗病毒筛选体系，成功鉴定出包括异甘草素（Isoliquiritigenin）在内的4种具有显著抑制PRRSV活性的化合物，为PRRSV疫苗开发和药物研发提供了重要技术支撑。

　　

BAC系统构建PRRSV感染性克隆

采用pBeloBAC11载体构建高致病性PRRSV-L251株的全长感染性克隆，通过HpaI/HindIII双酶切线性化后插入CMV启动子，形成pBeloBAC-CMV骨架。将病毒基因组分为三个重叠片段与3’UTR、丁型肝炎病毒核酶（Rz）、SV40 polyA信号序列共同组装，经NheI/SpeI酶切验证获得15kb插入片段。该系统利用BAC载体单拷贝特性有效维持大片段基因组稳定性，克服传统质粒载体易重组的缺陷。

EGFP报告病毒的设计与拯救

选择ORF1b-ORF2a、ORF4-5a和ORF7-3’UTR三个非重叠区作为外源基因插入位点，在EGFP基因两端引入保守的TRS6核心基序（5’-UUAACC-3’）。其中ORF4-5a构建体将TRS6置于EGFP下游以协调转录，而ORF1b-ORF2a构建体则采用上游插入策略。转染HEK-293T细胞后，rL251-ORF4-5a-EGFP在Marc-145细胞中呈现典型细胞病变效应（CPE），免疫荧光显示EGFP信号与N蛋白分布高度重合，证实报告基因与病毒复制的同步性。

报告病毒的稳定性与复制特性

连续传代实验揭示：

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  rL251-ORF1-2-EGFP虽能维持1450bp插入片段至P10，但病毒滴度较亲本株下降2个数量级，提示ORF1b-ORF2a插入严重影响复制功能

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  rL251-ORF7-EGFP从P4开始出现EGFP丢失，伴随病毒滴度回升至10^5.8 TCID₅₀/mL，显示基因组自我修复倾向

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  rL251-ORF4-5a-EGFP在P6前保持稳定表达，72 hpi病毒滴度达10^7.2 TCID₅₀/mL，与亲本株无显著差异（P>0.05）。多步生长曲线显示其复制动力学与野生型高度一致

抗病毒化合物筛选

采用CCK-8法确定化合物最大无毒浓度（MNTC）后，以P3代rL251-ORF4-5a-EGFP（MOI=0.1）感染Marc-145细胞进行筛选：

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  异甘草素在40μM时使病毒载量降低80%（P<0.001），TCID₅₀下降2.3个对数

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  白藜芦醇衍生物（Pterostilbene）通过剂量依赖方式抑制EGFP荧光强度，20μM处理组qPCR检测ORF7基因表达量减少45%

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  双盲法验证显示Brequinar对病毒颗粒组装具有特异性阻断作用

技术突破与应用前景

该研究首次在HP-PRRSV中实现TRS6调控的ORF4-5a位点稳定表达720bp外源基因，突破传统TRS5系统在P8即丢失插入片段的限制。建立的荧光可视化平台可实时监测病毒感染进程，为研究核衣壳蛋白（N）与内质网的相互作用提供新工具。筛选获得的DHODH抑制剂（Brequinar）和NF-κB通路调节剂（β-甘草次酸）为开发靶向病毒RNA合成的新型药物奠定基础。未来可通过缩短EGFP序列或改用纳米荧光标签进一步提升系统稳定性。