肽缀合磷酰二胺吗啉寡核苷酸(PPMO)的分子特性与构效关系研究：从溶液结构到药物递送优化

本研究针对肽缀合磷酰二胺吗啉寡核苷酸(PPMO)的结构-功能关系这一关键科学问题，通过结合圆二色谱(CD)、粘度测量与分子动力学(MD)模拟，首次揭示了22-mer、25-mer和30-mer PPMO在溶液中的非经典折叠结构特征。研究发现-GlyArg6肽段虽不改变PMO组分的结构特性，但显著影响溶液粘度行为，为优化PPMO制剂工艺提供了重要理论依据。该成果发表于《Molecular Therapy Nucleic Acids》，为开发更高效的抗肌萎缩蛋白(Dystrophin)外显子跳跃疗法奠定了结构基础。

　　

在基因治疗领域，反义寡核苷酸(ASO)犹如一把精准的"分子剪刀"，而磷酰二胺吗啉寡核苷酸(PMO)作为其特殊变体，凭借稳定的非离子型骨架在杜氏肌营养不良症(DMD)治疗中崭露头角。然而这把"剪刀"面临着一个关键瓶颈——如何高效穿透细胞膜？科学家们尝试给PMO装上"导航肽"(如-GlyArg₆)，形成肽缀合PMO(PPMO)，但这类复合分子的三维结构始终如同"黑箱"，严重制约了其优化设计。更棘手的是，高浓度PPMO溶液的异常粘度行为常常让制剂工程师们束手无策。

美国马萨诸塞大学Lowell分校的Evgenii Kliuchnikov团队联合Sarepta Therapeutics公司，在《Molecular Therapy Nucleic Acids》发表的研究犹如一盏明灯。研究人员选取靶向肌营养不良蛋白前体mRNA外显子45、53和51的22-mer、25-mer和30-mer PPMO为模型，构建了融合PMO与肽段的全原子力场，通过10次1微秒级分子动力学(MD)模拟捕获5500帧构象，结合圆二色谱(CD)和粘度实验，首次绘制出PPMO在溶液中的"分子肖像"。

关键技术路线包含：1）采用改进的AMBER力场进行全原子MD模拟；2）通过Barnaba软件分析碱基堆积和配对；3）结合支持向量机和非线性回归解析CD谱特征构象；4）利用HYDROPRO计算本征粘度；5）采用MM/GBSA方法计算折叠自由能。特别针对22-mer、25-mer和30-mer三种不同长度PPMO的系统比较，揭示了序列依赖性构效关系。

22-mer、25-mer和30-mer PPMOs的结构特征

研究发现所有PPMO均形成半径约1.4-1.5 nm的紧凑结构，带有4-6个碱基对和5-11个碱基堆叠。25-mer PPMO展现出独特的结构动力学：其3'-端PMO与-GlyArg₆肽段的氢键相互作用时间分数达14%-30%，显著高于22-mer(2%)和30-mer(3%)。这种差异源自25-mer序列中毗邻3'-端的嘧啶碱基（胞嘧啶和胸腺嘧啶）更易与精氨酸侧链形成氢键。

实验CD光谱的理论重建

通过非线性回归分析，团队识别出5-7个主导溶液构象（占群体85%-90%），其理论CD曲线与实验数据高度吻合。值得注意的是，270 nm处的正峰强度呈现22-mer>25-mer>30-mer的梯度变化，而210 nm处的负谷深度则以25-mer为最深。这种差异反映不同长度PPMO中电子离域程度的微妙变化。

粘度-浓度曲线的分子基础

在稀溶液（<30 mg/mL）中，三种PPMO粘度相近（η≈1.1 mPa/s），但在高浓度（70 mg/mL）时出现显著分化：25-mer粘度达4.24 mPa/s，远超22-mer(2.36 mPa/s)和30-mer(3.47 mPa/s）。Huggins常数分析表明，25-mer的k_H=9.7，暗示更强的分子间作用倾向。溶剂可及表面积(SASA)计算揭示，25-mer每个核苷酸的溶剂暴露面积最低，这与其高粘度行为相呼应。

PMO与PPMO的对比启示

尽管-GlyArg₆肽段自身呈无规卷曲（31%Turn+69%Coil），但其存在使PPMO折叠自由能(ΔG)比相应PMO更低（如25-mer PPMO ΔG=-71 kcal/mol）。特别重要的是，肽段通过增加分子表面亲水性，使PPMO在高浓度下的粘度始终低于对应PMO，这一发现为优化注射制剂提供了关键参数。

这项研究首次建立了PPMO溶液结构的"构象全景图"，揭示出三个关键规律：1）PMO组分主导整体结构，但肽段通过位置特异性相互作用（特别是25-mer 3'-端）调节分子柔性和溶液行为；2）嘧啶碱基更易与精氨酸侧链形成稳定氢键网络；3）SASA/核苷酸是预测制剂粘度的有效指标。这些发现不仅解释了临床观察到的25-mer PPMO特殊制剂挑战，更为设计新一代"可注射性"更优的PPMO提供了分子蓝图。正如研究者Valeri Barsegov指出："这项工作的真正价值在于将PPMO从经验优化带入理性设计时代——我们现在可以像工程师看待齿轮那样精确调控其分子特性。"