基于商业共聚焦显微镜的四通道光谱相量成像技术实现活细胞环境敏感探针的高效检测

本研究针对商业共聚焦显微镜缺乏光谱检测单元的问题，开发了一种基于四通道（4C）同步采集和光谱相量分析的新型成像方法。研究人员通过Leica SP8/STELLARIS8显微镜的4个连续光谱通道，实现了对环境敏感探针ACDAN和Nile Red的活细胞成像，可检测5 nm级光谱位移，并成功解混了mEmerald与EYFP荧光蛋白信号。该技术相比传统的lambda扫描模式具有更高时间分辨率和光子效率，为商业显微镜用户提供了便捷的先进光谱分析工具。

　　

在生命科学研究中，光谱成像技术犹如给显微镜装上了"彩色眼镜"，能够揭示荧光分子所处的微环境变化。然而，商业共聚焦显微镜用户常面临一个尴尬局面：昂贵的光谱检测单元并非标配，而传统的lambda扫描模式又存在时间分辨率低、光子浪费严重等问题，严重制约了活细胞研究的开展。这就像拥有高性能赛车却只能以自行车速度行驶——如何突破这个技术瓶颈，成为困扰许多实验室的现实难题。

来自意大利卡塔尼亚大学Luca Lanzanò团队在《Scientific Reports》发表的这项研究，给出了一份精巧的解决方案。研究人员巧妙利用商业共聚焦显微镜自带的4个检测通道，结合光谱相量（spectral phasor）分析方法，开发出一套"四两拨千斤"的技术路线。该方法不需要改造硬件，仅通过优化软件算法，就实现了媲美专业光谱检测单元的性能。

关键技术方法包括：1）使用Leica SP8/STELLARIS8显微镜同步采集4个连续光谱通道（带宽50 nm）的图像；2）基于傅里叶变换将光谱信息转换为相量图（g,s坐标）；3）通过相位波长图像可视化亚细胞区室的光谱差异；4）线性分解算法实现多组分荧光信号解混。实验样本涵盖HeLa细胞、HEK293T细胞和人肠道类器官，采用环境敏感探针ACDAN、Nile Red及荧光蛋白标记。

Spectral phasor成像原理验证

通过模拟数据验证了4C-spectral phasor对带宽>50 nm的荧光团具有5 nm级波长分辨力。实验测得ANS-BSA和Rhodamine 110溶液的相量位置差异显著，相位波长精度随光子数增加呈平方根关系提升，在300光子/像素时达1 nm精度。

ACDAN活细胞成像

在405 nm激发下，ACDAN在HeLa细胞中呈现490-510 nm的相位波长梯度：核内囊泡（490 nm）→质膜（495 nm）→核膜内陷（505 nm）→细胞核（510 nm）。

Nile Red多组分分析

该染料在488 nm激发下，其相量图呈现明显延伸特征，成功分解出脂滴（低极性）和内膜系统（高极性）两组分。

类器官实验进一步验证了该技术在复杂三维模型中的适用性。

荧光蛋白解混应用

对表达mEmerald-actin（峰值515 nm）和EYFP-CAAX（峰值527 nm）的HEK293T细胞，4C-spectral phasor清晰区分了两种蛋白的空间分布。

这项研究的意义在于将专业级光谱分析能力"民主化"。通过4C-spectral phasor方法，普通商业显微镜用户无需硬件改造即可：1）监测环境敏感探针的亚细胞定位变化；2）实现多荧光团的高效解混；3）开展活细胞动态观测。特别是对脂滴研究、细胞膜特性分析等领域提供了新工具。研究者特别指出，该方法在30 nm带宽设置下对绿色荧光蛋白变体的区分能力，为多色标记实验提供了新思路。未来或可拓展至更多商业显微镜平台，推动光谱成像技术的普及应用。