综述：Fmoc化学固相肽合成中的天冬酰亚胺形成及其预防

《ChemBioChem》：Aspartimide Formation and Its Prevention in Fmoc Chemistry Solid Phase Peptide Synthesis

这篇综述系统探讨了Fmoc固相肽合成(SPPS)中天冬酰亚胺(Asi)形成的机制及防治策略，重点分析了β-羧基保护基设计（如OMpe、CSY）、骨架保护方案（如Hmb、Dmb）和非碱性脱保护方法（如pNZ、DNPBS）的创新进展，为肽类药物研发提供了关键解决方案。

　　

天冬酰亚胺形成的挑战

在Fmoc固相肽合成(SPPS)领域，天冬酰亚胺(Asi)的形成始终是制约长肽合成的关键问题。这种五元环状副产物主要发生在天冬氨酸(Asp)残基处，特别是在Asp-Gly等易感序列中，其形成率可达70%以上。机理研究表明，碱性条件下肽链骨架酰胺氮对Asp侧链β-羧基的亲核进攻是主要诱因，后续还会产生α/β-肽异构体和哌啶加合物等难以分离的副产物。

保护基设计的进化

传统叔丁酯(OtBu)保护基因空间位阻不足导致防护效果有限。2-金刚烷基(1-Ada)和3-甲基-3-戊基(OMpe)等大位阻酯类可将Asi形成率降至5%以下，其中OMpe凭借柔性烷基链的构象干扰作用成为金标准。值得注意的是，Chen等开发的2-苯基异丙基(PhiPr)保护基在1%TFA条件下即可脱除，为糖肽合成中的正交修饰开辟了新途径。

非酯类保护新策略

突破性进展来自氰基硫叶立德(CSY)和氰基吡啶鎓叶立德(CyPY)保护策略。Neumann团队开发的CSY通过稳定的C=C键模拟羧酸酯，需N-氯代丁二酰亚胺(NCS)脱保护，而Bode团队发展的CyPY则兼容含水酸性条件。Mase等设计的Boc-酰肼(NHNMeBoc)通过铜催化水解实现脱保护，在氟乙酸脱卤酶合成中将Asi控制在1%以下。

骨架保护的双重优势

Sheppard提出的2-羟基-4-甲氧基苄基(Hmb)保护通过阻断关键酰胺氮的进攻，可完全抑制Asi形成。其衍生物2,4-二甲氧基苄基(Dmb)具有更好的溶解性和酸敏感性，而以2-羟基-6-硝基苄基(Hnb)为代表的光敏保护基则能实现时空可控脱保护。伪脯氨酸(ψ-Pro)策略在Ser/Thr存在时尤其有效，已成功应用于血管内皮生长因子受体(VEGFR)等重要靶点肽的合成。

工艺优化的创新

添加剂方面，乙基-2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酸酯(Oxyma)的缓冲效果优于传统HOBt。Michels发现5%甲酸可将甲状旁腺激素(PTH)合成中的Asi减少90%。碱性试剂中，吗啉因其弱亲核性成为替代哌啶的绿色选择。在保护基化学领域，对硝基苄氧羰基(pNZ)和2,4-二硝基-6-苯基苯硫基(DNPBS)等非碱性脱保护基团展现出独特优势。

未来发展方向

当前研究前沿聚焦于：①开发更高效的C=C/C=N类保护基；②优化骨架保护基的自动化引入方案；③发展兼容流动化学的新型保护策略。特别值得关注的是，这些方法在糖肽、环肽和蛋白翻译后修饰研究中的应用潜力，如HIV进入抑制剂C34糖肽的合成已取得重要突破。随着生物制药对复杂肽类需求增长，解决Asi形成问题将继续推动合成方法学的创新。