大规模转录组分析揭示ZFY1和ZFY2转录因子在雄性生殖细胞中的下游靶基因及其调控机制

本研究针对ZFY转录因子在雄性生育中的关键作用尚不明确的问题，通过构建Zfy1敲除（KO）、Zfy2 KO及双敲除（DKO）小鼠模型，利用大规模RNA测序技术分析了不同生精阶段的转录组变化。研究发现Zfy缺失导致精子发生、染色质组织和凋亡通路显著改变，并证实ZFY在人类细胞中同样调控凋亡通路。该研究揭示了ZFY作为减数分裂和精子形成关键调控因子的新机制，为男性不育的机制研究和治疗提供了重要理论依据。

　　

在哺乳动物雄性生殖系统中，Y染色体编码的锌指蛋白基因ZFY一直是个神秘而重要的角色。虽然早在30多年前就被发现，但它在精子形成过程中的具体功能机制始终笼罩在迷雾中。科学家们知道ZFY对男性生育力至关重要，但它是如何调控精子发生过程的？它直接影响哪些基因的表达？这些问题的答案一直困扰着研究者们。

近年来，随着基因编辑技术的成熟，研究者们终于能够构建精确的Zfy基因敲除小鼠模型来探索这些谜题。通过制备Zfy1单敲除、Zfy2单敲除和Zfy1/2双敲除小鼠，研究团队发现双敲除雄性完全不育，而单敲除则表现出不同程度的生育缺陷。这提示ZFY蛋白在精子发生过程中扮演着多重角色，但具体的分子机制仍需深入探索。

为了揭示ZFY的调控网络，研究人员采用了荧光激活细胞分选技术（FACS）分离获取了三种关键生殖细胞：初级精母细胞（SC1）、次级精母细胞（SC2）和圆形精子细胞（RS）。通过对48个样本进行大规模RNA测序分析，获得了16亿条读长数据，从而能够全面解析Zfy缺失对转录组的影响。

研究主要采用了以下关键技术方法：通过FACS分选获得高纯度生殖细胞群体；使用Illumina NextSeq 2000平台进行高通量RNA测序；采用DESeq2等生物信息学工具进行差异表达基因分析；通过基因集富集分析（GSEA）和通路富集分析探索功能变化；利用染色质免疫染色（CMA3和苯胺蓝染色）评估精子染色质状态；通过体外受精实验验证功能性影响；使用蛋白质印迹和免疫荧光分析蛋白表达变化。

Zfy2 KO和Zfy DKO生殖细胞转录组发生显著改变

通过主成分分析发现，细胞类型是转录组变异的主要来源，但Zfy2 KO和Zfy DKO相比野生型显示出显著的转录组改变。差异表达分析显示，Zfy DKO在SC1、SC2和RS中分别有1272、283和3407个差异表达基因（DEGs），而Zfy2 KO的DEGs数量更多，表明Zfy2在转录调控中起主导作用。

Zfy缺失导致性染色体基因表达失调

研究发现Zfy DKO中性染色体基因显著上调，特别是Y染色体上的Sly、Ssty1和Ssty2等多拷贝基因。在圆形精子细胞中，约70%的上调基因位于X或Y染色体上，提示Zfy缺失影响了减数分裂性染色体失活（MSCI）和减数分裂后性染色质抑制（PSCR）过程。

Zfy2和Zfy DKO缺失导致染色质相关通路上调

通路分析显示，在Zfy2 KO和Zfy DKO圆形精子细胞中，染色质重塑和核小体过程相关基因显著上调。基因集富集分析发现"染色质结构组成"和"核小体"通路在Zfy DKO RS中显著富集。 motif富集分析预测HOXC12和HMBOX1可能是ZFY的共调控因子。

Zfy缺失导致减数分裂后染色质重塑缺陷

通过CMA3和苯胺蓝染色发现，Zfy DKO和Zfy2 KO精子染色质包装异常，组蛋白保留增加。蛋白质分析显示Zfy DKO精子中前PRM2积累，PRM1/PRM2比例改变，表明组蛋白-鱼精蛋白转换过程受损。

精子发生通路在Zfy DKO圆形精子细胞中下调

Zfy DKO RS中精子鞭毛和轴丝组装相关通路显著下调，这与Zfy DKO精子严重的形态异常和运动障碍表型一致。Zfy2 KO精子虽然运动能力正常，但体外受精能力显著下降，提示存在其他功能缺陷。

Zfy缺失导致凋亡通路基因上调和生殖细胞凋亡增加

基因集富集分析发现凋亡相关基因集在Zfy KO精母细胞中显著富集，包括P53、TGF-β和KRAS信号通路。TUNEL检测证实Zfy DKO睾丸中凋亡生殖细胞数量显著增加，支持ZFY在凋亡检查点调控中的作用。

ZFY在人类细胞中调控凋亡和细胞周期通路

通过在HEK293细胞中过表达人ZFY基因，发现ZFY调控细胞周期和DNA损伤应答通路，但与小鼠生殖细胞不同，未观察到性染色体基因的特异性调控，表明ZFY的功能具有细胞类型特异性。

Zfy缺失影响选择性剪接

研究发现Zfy KO模型中数百个转录本的选择性剪接发生改变，主要影响外显子跳跃和内含子保留事件。这些剪接变化影响的通路与差异表达基因分析结果相似，进一步扩大了ZFY的调控范围。

研究结论表明，ZFY转录因子通过调控数百个基因的表达和选择性剪接，在雄性生殖细胞发育过程中发挥核心调控作用。Zfy2在功能上比Zfy1更为重要，其缺失导致更严重的转录组紊乱和表型缺陷。ZFY通过影响染色质组织、凋亡调控和精子发生通路，确保正常的精子形成过程。特别值得注意的是，ZFY对性染色体基因的调控具有生殖细胞特异性，这可能与其在减数分裂性染色体失活过程中的作用相关。

这项研究的重要意义在于首次全面揭示了ZFY转录因子在体内条件下的下游靶基因网络和调控机制，为理解男性不育的分子基础提供了重要见解。研究发现ZFY在凋亡通路调控中的功能在人类细胞中保守，但在性染色体基因调控方面具有生殖细胞特异性，这一发现为开发男性避孕药物和治疗男性不育提供了新的靶点思路。同时，研究建立的Zfy基因敲除小鼠模型和获得的转录组数据资源将为后续研究提供重要基础。

论文发表在《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》杂志，为细胞死亡与分化领域提供了关于转录因子调控生殖细胞发育的新视角，对理解细胞命运决定和程序性细胞死亡在生殖系统中的调控机制具有重要贡献。