厚生物样品电子显微成像中的相位与振幅对比机制研究及其在冷冻电镜技术中的突破性应用

本综述深入探讨了厚生物样品在电子显微成像中的对比机制，聚焦于相干明场相位对比与非相干暗场振幅对比的贡献。通过构建T4噬菌体模型并采用多层切片模拟技术，系统比较了透射电镜（TEM）与扫描透射电镜（STEM）在不同成像模式下的性能差异。文章重点分析了能量过滤对成像信噪比的影响，指出STEM技术因无需后透镜成像而能够充分利用非弹性散射电子，在超越弱相位近似（WPO）的厚样品成像中展现出显著优势。研究结果证明，在约700 keV加速电压下优化收集角度，可实现对1 μm厚玻璃冰包埋样品中病毒结构的清晰成像，为冷冻电子断层扫描（cryo-ET）和冷冻扫描透射电子断层扫描（CSTET）技术提供了重要理论依据。

　　

1 INTRODUCTION

生物结构在各级尺度上均具有三维特性。虽然电子显微镜能够生成原子分辨率图像，但使用任何电离辐射探测生物结构并进行三维图谱绘制的能力受到辐射损伤的限制。通过将电子曝光分散到多个结构副本的策略在蛋白质结构解析中取得显著成功，但该技术如何应用于细胞或细胞器内容物的独特结构图谱绘制仍不明确。冷冻显微镜技术在保存天然结构方面被证明具有不可估量的价值，通过多投影重建（即断层扫描）可实现三维结构重建。在冷冻电子断层扫描（cryo-ET）中，投影结构图像通过电子显微镜的投影透镜系统记录在像素化区域探测器上。另一种技术是冷冻扫描透射电子断层扫描（CSTET），通过聚焦探针在样品上扫描，并整合一定散射角度范围内的信号形成图像。

一般认为冷冻透射电镜（cryo-TEM）研究的样品属于弱相位物体（WPO），其对比源于未散射电子与样品弱散射电子之间的干涉，表现为恒定背景上的小幅调制。对遗传物质、蛋白质和玻璃冰的散射势差异分析表明，即使对于300 keV电子，该近似仅适用于厚度约50 nm的物体。因此，冷冻电子断层扫描研究的样品通常是混合相位/振幅物体，较厚样品更可能表现为振幅物体。对于由轻元素组成的生物样品，非弹性散射概率约为弹性散射的3倍。即使在通过有效孔径内电子干涉产生相位对比的条件下，仍存在散射到该孔径外角度所产生的振幅对比贡献。对于强相位物体，弱相位物体条件不再适用时也会出现振幅对比。

样品非弹性散射导致物镜色差引起的离焦扩散。为减轻由此产生的空间分辨率下降（即图像模糊），通常记录从零损失（弹性散射）峰的能量过滤图像。对于单颗粒分析，这种零损失能量过滤特别适用于中等厚度样品的高分辨率信息恢复，其中强度损失可通过收集更大数据集来补偿。对于断层扫描，样品厚度通常是支持三维上下文信息的目标，我们考虑选择能量损失谱中的不同区域以最大化测量信号。能量选择的缺点在于仅有一部分散射电子用于成像，而其余部分仍导致辐射损伤。冷冻扫描透射电子断层扫描（CSTET）不具有这些缺点，因为用于成像的散射电子不受物镜色差影响。此外，由于几乎所有散射电子都可以使用具有高动态范围的现代像素化探测器收集，可以选择最大化信噪比或优化空间分辨率的角度范围。甚至可以根据较高倾斜角度的增加厚度动态调整这些参数。使用STEM检查厚样品的能力使得记录和重建完整、玻璃化的疟原虫细胞断层扫描成为可能，以及在液相中成像癌细胞和当被石墨烯膜包裹时在水中的耐辐射奇球菌细胞。最近，还有一些探索使用MeV STEM进行纳米级完整细胞成像的研究进展。

也可以通过STEM生成相位对比图像。最全面的方法是记录每个探针位置的完整衍射数据（4D STEM）。通过互易性，这可以等效于具有倾斜光束照明的TEM明场，覆盖由探测器和相机长度定义的角度范围。对每个倾斜方向的图像位移进行视差校正，并将每个探测器像素（或像素范围）的图像贡献相加。对于非弱相位物体，这会产生与常规TEM成像相比信噪比大大提高的相位对比图像。这是因为所有明场电子都用于成像，而不仅仅是能量过滤器选择的窄能量范围内的电子，且有效对比传递函数传递了更宽的空间频率范围。

冷冻电子断层扫描或冷冻扫描透射电子断层扫描的应用之一是研究病毒衣壳内遗传物质的组织。为探索可能实现的对比度，我们使用了不同厚度玻璃冰中的T4噬菌体模型。该模型使用Penelope几何引擎构建，具有蛋白质衣壳和同心圆柱体组织的DNA。该几何引擎可用于从有效势和代表照明孔径外散射的吸收系数指定组成样品的不同切片的相位光栅。考虑能量过滤需求的TEM对比度使用多层切片代码计算；STEM对比度使用相同的多层切片代码通过求和不同探测器像素的贡献来计算。模拟的STEM图像具有更高的信噪比，因为没有电子因非弹性散射而损失。对于纯非相干成像，使用Penelope蒙特卡罗代码计算各种探测器配置的STEM图像。当噬菌体嵌入400 nm玻璃冰中时，在200 keV电子的两个非常不同的正交投影的模拟STEM图像中可以分辨出遗传物质和衣壳。

1.1 Calculating phase contrast

平均而言，水约占细胞内容的70%。相位对比来自于任何大分子与水之间透射波相位偏移的差异，在冷冻显微镜中，水呈现为玻璃冰的形式。蛋白质是最丰富的大分子，其次是遗传物质（RNA或DNA）、碳水化合物和脂质。穿过厚度为t的材料产生的相位偏移φ由材料平均散射电位（以伏特为单位）和相互作用常数σ决定，其中σ由电子质量、洛伦兹因子和电子波矢量给出。

由于我们这里不关注原子分辨率结构，使用平均内电位是可以接受的。对于小角度，可以方便地根据电子散射因子计算相位偏移。玻璃冰、蛋白质和遗传物质中各种原子的比例用于计算，其密度用于区分蛋白质或DNA与水。

考虑到大多数结构对比将来自蛋白质和玻璃冰之间的差异，我们可以计算被玻璃冰包围的蛋白质厚度，该厚度将产生1弧度的相位差。结果显示，对于不同的加速电压，给出1弧度相位差的蛋白质厚度变化不大，使用1 MeV或4 MeV电子几乎没有差异。这是因为用于电子散射电位的相对论校正中使用的洛伦兹因子γ和波长λ的乘积随加速电压变化不大，说明非常高加速电压并未大大扩展弱相位物体近似有效的范围。非相干散射的弹性或非弹性平均自由程与β2成比例，其随加速电压的变化显示，MeV加速电压并未带来优势。

将弱相位物体（WPO）的相位差限制设置为1弧度已经相当宽松。从sinθ的展开来看，与小角度近似θ的差异将为16%，这对数据的定量分析有些问题。从这些估计可以看出，厚的生物物体不是弱相位物体。

特别是对于厚样品，不仅存在相位对比，还存在振幅对比，这种对比源于散射到用于TEM成像或STEM照明的角度范围之外的电子。我们注意到，对于给定的空间分辨率d，照明半收敛必须包括高达角度λ/2d的散射矢量。散射到更高角度将呈现为振幅对比，即使来自弱相位物体。对于厚样品，通常减少收敛以增加景深，特别是对于断层扫描，其中最方便地将简单投影重建为3D。尽管如此，实验上观察到显著的STEM相位对比，直至由收敛定义的极限分辨率。

角度范围可能受到对比传递函数（CTF）的限制，该函数受时间和空间非相干性的适当包络函数修改。这将取决于显微镜的操作条件，特别是离焦量。代表性CTF和包络函数显示，用于FEI F20 Cs = 2.0 mm的200 keV电子，分别适用于接近Scherzer焦点的高分辨率成像条件、适用于约1 nm大小特征的500 nm中间离焦以及可用于挑选生物分子整体形状的低分辨率条件。随着离焦增加，相干通带移至较低空间频率，使得物体更容易看到。对于较高空间频率（需要高收集角度），传递函数存在振荡； resulting contrast inversions must be corrected in the image for proper interpretation. These oscillations are damped by the temporal coherence function due to the spread of energies from the electron gun and instabilities in the objective lens power supply, as well as the spatial coherence function that arises from the incident beam convergence. For STEM, the equivalent of the beam convergence is the angle subtended by a detector pixel. The temporal coherence is more important near Scherzer, or optimum defocus for high-resolution imaging, whereas the spatial coherence is more significant at large values of defocus. These act to impose an effective cut off in scattering angles. Alternatively, the angular range could be defined by a phase plate acting on the scattered electrons. In some cases the angular range might be defined by an objective aperture. Without loss of generality we can state that this scattering does not contribute to a bright-field phase contrast image. Its strength can be incorporated into an absorption coefficient μ, which leads to an attenuation in the bright-field image. This would be the same in STEM for a small objective aperture defining the bright-field image.

1.2 Multislice calculations

多层切片算法是计算材料科学中原子分辨率图像的标准方法，通过在实空间波函数乘以相位光栅exp(iσV(x,y)Δt)与通过距离Δt传播到下一个切片之间迭代。这通过取波函数的傅里叶变换并乘以传播子exp(-iπλq2Δt)，然后执行逆傅里叶变换来计算最方便。这里我们应用多层切片算法计算厚样品中生物结构的纳米分辨率相位对比图像。

多层切片计算范围之外的角度的散射吸收可以通过使势场复杂化来有效考虑，其中势场的虚部是μ/2σ。

切片厚度应选择为充分采样势场由结构变化引起的变化。如果变化缓慢变化，切片厚度将取决于可接受的误差。对单个切片的误差E的分析表明，它随Δt2变化，其中Δt是切片厚度，θM是由计算中实空间采样定义的最大角度。对于表示结构的单元格长度为L，分为N个元素，最大角度θM为λN/2L。

对于T4噬菌体衣壳所需的128 nm × 128 nm视场，200 keV多层切片中的最大角度沿单元格侧面为5 mrad。由于固定厚度的切片数量与切片厚度成反比，总误差随切片厚度缩放。多层切片计算误差在实践中可能很小的原因是散射因子或势场在大散射角度下降，因此即使乘以θ2，它仍然可以接受地低。使用噬菌体在玻璃冰中的准则，2 nm的切片厚度将确保总误差小于10%。

然后，出射表面的倒易空间中的波函数可以通过像差函数进行相移，乘以适当的包络函数。相移和散射角限制波函数的傅里叶变换是一个复振幅，从中可以导出最终的图像强度作为模平方。

具有场发射点源的STEM中的相位对比可以通过互易性关联到TEM中的相位对比。相位对比源于照明锥中不同方向θ1和θ2的散射之间的干涉。散射电子以角度ω离开样品，并形成探测器元件接收的信号。在最简单的形式中，探测器可以是用于微分相位对比的四象限，但在现代实践中， advantageous to use multi element direct electron detectors to collect the complete angular scattering distribution for each probe position, a practice known as 4D STEM. By reciprocity the scattering angle ω is equivalent to an illumination tilt, and the image observed by STEM is the same as the image for tilted illumination in TEM. Rose derived the contrast transfer function for a weak phase object for tilted illumination. To calculate the image for specimens that are not weak phase objects we will consider a specimen whose amplitude at the exit surface is the complex function A(θ), where θ is the scattering angle in the specimen. For simplicity, we will assume that A(θ) does not depend strongly on illumination angle ω, similar to the treatment of beam convergence in high resolution electron microscopy in materials science. The wave function after allowing for phase shifts from lens aberrations is given, and the image intensity is derived. Expanding the phase shift term gives contributions that include an image shift which would be corrected when summing the contributions from the different scattering angles corresponding to individual pixels. It can therefore be neglected in calculations of the phase contrast STEM signal. The 3rd and 4th terms multiplying Cs are higher order in angle and can be neglected when examining thick samples with low beam convergence. As a result, tilt corrected bright field effectively gives the same image as phase contrast TEM while using convergent illumination.

1.3 Inelastic scattering

在TEM中，非弹性散射电子由于物镜中的色差而不聚焦到唯一平面。这种效应为任何图像贡献了离焦背景，因此在实践中，用能量过滤器选择窄范围的能量。通常这与零损失峰一致，但已证明对厚样品使用其他损失窗口成像。显然，需要最大化信号，特别是对于冷冻显微镜。为了确定最佳能量窗口以及实际上可用于成像的入射电子比例，我们记录了来自不同厚度玻璃冰的能量损失谱。

光谱在200 kV加速下记录，使用半收敛角为0.47 mrad、探针电流约为15 pA的STEM微探针模式。半收集角为17 mrad，光谱从DECTRIS ELA探测器上的1028 × 130像素提取，每通道0.5 eV，覆盖512 eV范围。根据总光谱强度与零损失强度之比估计非弹性平均自由程λimfp的厚度。此外，使用150 μ聚光器孔径（对应1.4 mrad半收敛角）增加探针电流，并钻穿玻璃冰。当样品倾斜25°时，从图像中测量的孔长度独立估计厚度。

低于230 nm时，大部分强度在零损失峰中。对于高达约600 nm的较大厚度，约20 eV的等离子峰占主导。对于厚度近1微米的非常厚的样品，光谱呈现朗道分布形式，其峰值在约130 eV处是最突出的特征。就非弹性平均自由程而言的厚度估计对于较厚区域可能不准确，因为将有非弹性散射在EELS收集孔径之外。因此，我们估计非弹性平均自由程为157 nm，从最薄区域显示，这是弹性平均自由程的0.27倍。

选择等离子体或更高能量损失的窗口中的能量范围也将降低时间相干性。对于零损失峰，FEG源的窄能量扩展决定了时间相干性以及 resulting decay in the contrast transfer function for imaging with the zero loss peak. This is not the case for imaging using the plasmon, whose half width is about 10 eV, or the peak in the Landau distribution if a 20 eV window is chosen. The temporal coherence function that acts as an aperture in phase contrast imaging is shown. Spatial resolution due to temporal coherence is limited to 0.6 nm for imaging using the plasmon peak, and 1.0 nm imaging using the peak of the Landau distribution.

还应考虑非弹性散射电子角度扩展导致的空间相干性下降。非弹性散射的强度在200 keV时高达约7 mrad大于弹性散射，并且，正如所指出的，与代表原始空间相干性推导中 broad source的高斯分布相比，等离子体偶极散射产生的洛伦兹分布有更多散射到大角度。空间相干函数显示，对于20 eV等离子体损失和130 eV朗道分布峰值对应的损失。考虑到对C? Δf q3的依赖，在2 μm和5 μm离焦下空间分辨率受到严重限制并不奇怪。在5 μm离焦下，当空间相干函数下降2倍时，空间分辨率对于等离子峰成像约为2 nm，对于朗道分布峰值成像约为10 nm。在实践中，这些可能不是主要限制，考虑到选择这些能量的样品的厚度。更重要的是信号损失。对于所示情况，对于20 eV能量选择窗口，仅约8%–9%的入射电子用于成像。超过90%的入射电子不提供有用的成像信息，仍然损坏样品。对于玻璃冰本身，对于大于230 nm的厚度，使用等离子体进行成像变得最优。从该分析来看，尝试使用朗道分布峰值进行EFTEM成像似乎不值得，甚至对于等离子峰成像也处于边缘。

原则上，恢复非弹性散射存在下相位对比的色差校正器应等效于STEM，但空间分辨率分析还应考虑空间和时间相干性的额外贡献。作者指出，通过在零离焦操作相位板可以避免空间相干性减少的有害影响。这可能极大地有益于分子结构研究，但再次限制了样品厚度。

1.4 Simulated images for a model phage

为了在理论水平上研究冷冻电子断层扫描和冷冻STEM断层扫描如何比较，我们使用Penelope几何引擎构建了T4噬菌体衣壳模型。二十面体衣壳由平面定义，DNA以同心圆柱体排列，之间有1 nm间隙。选择这种DNA排列作为测试分辨率的合适几何结构，尽管我们认识到它可能不是结构的准确描述。衣壳和DNA的相对体积取自Yap和Rossman提供的数据。Penelope几何引擎命令列表在补充信息中给出。模型噬菌体的3个正交视图显示。

为了计算来自非相干散射的CSTET图像，我们使用了Penelope蒙特卡罗代码，遵循与Rez等人使用的相同程序。蒙特卡罗代码使用随机数从积分截面采样散射角和能量损失。散射电子沿着它们的新行进方向被跟踪一个随机距离，直到它们经历另一个散射事件。通过跟踪多个轨迹建立散射电子的角度分布。由于角度分布和路径长度采样的限制，Penelope代码不适用于薄于约300 nm的玻璃冰样品。在实践中，这可能不是严重限制，因为非相干散射对较薄样品的图像对比贡献不大。在我们的计算中，10,000个电子入射到1 nm像素上，并统计到达0–7 mrad（明场）、10–20 mrad、20–30 mrad和30–44 mrad范围内探测器的数量。这些对应于OPAL分段STEM探测器（El Mul Technologies Ltd.）的探测器段。对于1 MeV，散射角度按电子波长比变化，探测器段更改为0–2.43 mrad、3.5–7.0 mrad、7.0–10.4 mrad和10.4–15.3 mrad。每像素电子数匹配可能用于CTSET的电子曝光（100 e^?/?²），探针步进超过110×110网格，给出110×110 nm视场，大致对应衣壳大小。

TEM对比度计算使用稍大的单元格，尺寸为128 nm × 128 nm。为方便执行多层切片计算所需的快速傅里叶变换，用512×512点采样。相位光栅从平均电子散射因子计算，假设散射超过6 mrad的电子被“吸收”。这对应于0.42 nm的空间分辨率。电子加速电压选为200 keV，C?为2 mm，典型于FEI F20，物镜孔径半角为4 mrad。为了模拟非弹性散射导致的零损失电子损失， fluence reduced to 28% of the incident fluence, since the 200 nm ice thickness corresponded to 1.27 inelastic mean free paths. It was assumed that the detector was almost perfect and that the only noise came from Poisson statistics of electrons arriving in a given pixel, simulated by random sampling from a Poisson distribution.

用于倾斜校正明场STEM图像的束收敛选为3 mrad，因为这给出了277 nm的景深，大于选择包埋噬菌体的200 nm玻璃冰厚度。假设探测器覆盖4 mrad的角度范围，并分为20个环形环和90个方位角段（4°切片）。使用TEM多层切片代码的修改版本，波前像差函数给出，没有倾斜贡献。由于没有能量选择，电子注量没有减少。

2 RESULTS AND DISCUSSION

模拟的相位对比图像对于TEM和STEM在离焦值0.5 μm以及常用于低分辨率挑选物体整体形状的2 μm和5 μm离焦值显示。校正STEM中探测器像素的图像位移意味着对比度将与TEM中观察到的相同，并且由于探测器收集的角度范围与束收敛匹配，收集效率优化。单个探测器像素张开的角度等效于TEM中的束收敛，其效果可以由空间相干包络函数表示。计算显示电子注量为4 electrons/?²的图像。由于根据非弹性平均自由程估计零损失仅具有28%的入射电子，TEM图像比STEM图像噪声更大。

STEM中的对比度比常规TEM成像大大提高，与Yu等人的结果一致。这是利用所有电子（包括那些非弹性散射电子）的结果。考虑到明场甚至对于非相干散射更有利于高分辨率成像，Du和Jacobsen的理论可以用于给出电子注量和对比度的一阶估计。

显示噬菌体在400 nm玻璃冰中指定方向的非相干STEM对比度。在所有情况下，除了明场图像，DNA的同心圆柱体清晰可见。正如预期，明场（0–7 mrad）与暗场（其他探测器角度）的对比度发生变化。对于指定的侧视图，有通过噬菌体的投影，沿着电子路径长度的DNA和衣壳蛋白厚度大大减少。因此，对比度较低。还对两种方向进行了计算，噬菌体在400 nm玻璃冰中靠近入口表面100 nm深度以及靠近出口表面300 nm深度。未看到对比度的明显差异，证实暗场中不存在顶底效应。

最终我们的目标是对约1微米厚的细胞器或原核细胞中的特征成像。这大约是玻璃冰中弹性平均自由程的两倍，因此角度分布将通过多次散射展宽。尽管噬菌体与原核细胞中可能存在的结构相比很小，当我们考虑噬菌体在1米玻璃冰中心时，我们仍然可以深入了解在较厚样品中成像的可能性。显示200 keV和1 MeV的明场和暗场探测器的模拟。正如早期工作所示，明场对于非常厚的样品更优越，因为大角度散射事件贡献减少，这些事件会降低空间分辨率。似乎1 MeV将是加速电压的更好选择，因为关键特征在暗场探测器中仍然可分辨。这