条件性永生化间充质干细胞及其细胞外囊泡治疗间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征的研究

本研究针对间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征(IC/BPS)治疗中存在的间充质干细胞(MSCs)来源受限和异质性等问题，通过建立可逆永生化间充质干细胞(iMSCs)模型，系统评估了其分泌的细胞外囊泡(EVs)的治疗潜力。研究证实iMSCs在保留原代MSCs(pMSCs)特性的同时实现规模化扩增，其分泌的iMSC-EVs在体外和体内模型中均展现出与pMSC-EVs相当的抗炎和组织修复能力，为IC/BPS治疗提供了新型标准化细胞资源。

　　

间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征(IC/BPS)是一种以慢性盆腔疼痛为特征的难治性泌尿系统疾病，现有治疗手段效果有限。近年来，间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)因其强大的抗炎和免疫调节功能成为研究热点，而MSCs分泌的细胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs)因其无细胞特性更具备临床转化潜力。然而，原代MSCs(primary MSCs, pMSCs)存在供体差异、扩增能力有限等问题，严重制约了MSCs-EVs的标准化生产。

为突破这一瓶颈，Guolong Liao和Canling Long等研究者创新性地采用Tet-on调控的猿猴病毒40大T抗原(Simian virus 40 Large T, LT)表达系统，成功构建了条件性永生化MSCs(immortalized MSCs, iMSCs)。这项发表在《Stem Cell Research & Therapy》的研究证实，iMSCs在保留pMSCs生物学特性的同时，可通过多西环素(doxycycline, dox)精确控制其增殖状态，并分泌具有治疗潜力的iMSCs-EVs。

关键技术方法包括：1) 采用Tet-on系统构建LT条件表达载体；2) 通过流式细胞术和分化实验验证iMSCs表型；3) 超速离心法分离EVs并通过Western blot、电镜和纳米颗粒追踪分析进行表征；4) 建立脂多糖/三磷酸腺苷(LPS/ATP)诱导的SV-HUC-1细胞损伤模型；5) 采用环磷酰胺(Cyclophosphamide, CYP)诱导IC/BPS小鼠模型评估治疗效果。

Generation of Conditionally Immortalized Human MSCs

研究团队通过慢病毒载体将dox诱导的LT表达系统导入pMSCs，成功获得iMSCs。免疫荧光和Western blot证实LT表达严格受dox调控，撤除dox后6天完全消失。增殖实验显示iMSCs在dox存在下可稳定扩增至60代以上(PD60)，PD时间约32小时，而撤除dox后增殖能力显著降低。

iMSC retains the main characteristics of pMSC

流式分析显示iMSCs保持CD73⁺/CD90⁺/CD105⁺的MSCs特征表型，且与pMSCs无显著差异。值得注意的是，dox处理与否不影响表面标志物表达，但持续LT表达会抑制分化潜能。

Osteogenic and adipogenic differentiation capacities of iMSCs

撤除dox后，iMSCs在PD40内保持与pMSCs相当的成骨和成脂分化能力。ALP染色、油红O染色及RUNX2、PPARγ等标志基因表达分析证实，iMSCs可分化为功能性骨细胞和脂肪细胞，但PD60时分化能力显著下降。

Switching of iMSCs Between Immortalized and Non-Immortalized State

通过dox交替处理证实iMSCs可在增殖态和分化态间可逆转换。重新添加dox可使细胞恢复增殖能力，而撤除dox后仍能有效分化为成骨细胞，ALP活性和矿化结节形成与pMSCs相当。

Characterizing EVs Secreted from iMSCs

超速离心获得的iMSC-EVs直径100-150 nm，电镜显示典型双层膜结构。Western blot检测到TSG101、CD81等EV标志物，且miRNA-9、miRNA-146a-5p等功能性内容物与pMSC-EVs无显著差异。PD20-PD60的iMSCs分泌EVs的产量和内容物保持稳定。

Protective Effects of iMSC-EVs on LPS/ATP-Induced Damage

DiR标记实验证实SV-HUC-1细胞可有效内化iMSC-EVs。在LPS/ATP诱导的炎症模型中，iMSC-EVs显著提升细胞活力，降低IL-1β和TNF-α水平，并恢复E-cadherin、UPK1A等上皮屏障标志物表达，效果与pMSC-EVs相当。

Therapeutic Activity in IC/BPS Mouse Model

CYP诱导的IC/BPS小鼠经膀胱壁注射iMSC-EVs后，湿膀胱重量减少约40%。H&E和Masson染色显示炎症浸润和纤维化显著改善，膀胱组织中IL-1β、TNF-α表达下调，而uroplakin表达恢复。尿液标志物PGE2和NAG水平明显降低。

该研究首次建立了可逆永生化MSCs系统，解决了MSCs-EVs临床应用中的细胞来源瓶颈问题。iMSCs不仅保留pMSCs的核心生物学特性，其分泌的EVs更在IC/BPS模型中展现出与pMSC-EVs相当的抗炎和组织修复能力。特别值得注意的是，通过Tet-on系统实现的增殖-分化状态可逆调控，为标准化生产治疗性EVs提供了新思路。研究团队建议未来应开展iMSC-EVs的组学分析，进一步阐明其治疗分子机制。这项技术突破不仅为IC/BPS治疗带来新希望，更为其他难治性炎症疾病的EVs疗法开发提供了普适性方案。