白喉棒状杆菌ChtA和HtaA血红素载体通过保守区域结构域捕获血红素的结构基础

研究人员针对白喉棒状杆菌(C. diphtheriae)获取铁营养的关键机制展开研究，揭示了其分泌的ChtA和HtaA血红素载体蛋白通过保守区域(CR)结构域捕获血红素(hemin)的分子机制。通过X射线晶体学、共振拉曼光谱和等温滴定量热法等技术，首次定量测定了CR结构域与血红素的解离常数(0.8-22 nM)，阐明了酪氨酸-铁配位键的独特结合模式，为理解病原菌铁获取途径及开发新型抗菌药物提供了重要依据。

　　

铁是细菌生长必需的关键营养素，但在感染过程中，宿主体内的铁大多以血红素(heme)形式存在，特别是血红蛋白(Hb)中含有超过75%的人体铁储备。白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)作为白喉病的病原体，必须从宿主体内获取铁才能繁殖。然而，宿主进化出了复杂的防御机制：血红蛋白被氧化为高铁血红蛋白(metHb)后，会迅速被结合珠蛋白(Hp)捕获清除；游离的血红素则被血凝素清除。这给病原菌的铁获取设置了重重障碍。

面对这种"铁限制"环境，白喉棒状杆菌发展出了一套精密的血红素获取系统。流行病学菌株编码五种含有保守区域(Conserved Region, CR)结构域的蛋白质：ChtA、ChtB、ChtC、HtaA和HtaB。其中ChtA和HtaA被分泌到细胞外作为"血红素载体"(hemophore)，但人们对这些蛋白质如何从血红蛋白获取血红素，以及CR结构域结合血红素的分子机制知之甚少。

为回答这些问题，加州大学洛杉矶分校的Robert T. Clubb团队在《Journal of Biological Chemistry》发表了这项研究。研究人员首先通过紫外-可见光谱和核磁共振(NMR)实验证明，ChtA和HtaA的CR结构域并不直接结合血红蛋白，而是被动捕获从血红蛋白自发释放的血红素。随后他们解析了ChtA^CR和HtaA^CR1与血红素的晶体结构，发现这些结构域采用β-三明治折叠，通过α1螺旋中的酪氨酸(Tyr129/Tyr49)与血红素铁形成五配位键。有趣的是，ChtA^CR使用独特的"辅助酪氨酸"(Tyr178)来稳定轴向配体，而其他CR结构域则使用组氨酸作为辅助残基。

共振拉曼光谱和电子顺磁共振(EPR)证实了溶液中五配位高自旋铁的存在。等温滴定量热法(ITC)首次定量测定了ChtA^CR与血红素的解离常数(K_D=22 nM)，发现结合过程主要由焓驱动。通过定点突变，研究人员发现ChtA^CR中独特的Lys177-Tyr178-Tyr129相互作用网络对维持高亲和力至关重要。最后，利用原生电喷雾电离质谱(nESI-MS)的血红素分配实验，研究人员比较了不同CR结构域的亲和力，发现HtaA^CR2的K_D高达850 pM，而ChtA^CR相对较低(22 nM)，这种亲和力差异可能指导血红素在细胞内的定向流动。

主要技术方法：

研究采用X射线晶体学解析了ChtA^CR和HtaA^CR1与血红素的复合物结构；通过紫外-可见光谱和核磁共振分析了蛋白质相互作用；利用共振拉曼光谱和电子顺磁共振表征了铁配位环境；采用等温滴定量热法定量测定结合亲和力；运用原生电喷雾电离质谱进行血红素分配实验比较不同CR结构域的亲和力差异。

CR结构域被动捕获血红蛋白释放的血红素

通过血红蛋白释放动力学实验发现，ChtA^CR、HtaA^CR1和HtaA^CR2以与已知速率常数相符的速度捕获从血红蛋白自发释放的血红素。核磁共振实验进一步证实这些CR结构域不与血红蛋白直接相互作用，而是被动获取释放的血红素。

ChtA和HtaA的血红素结合结构特征

晶体结构显示ChtA^CR采用独特的Tyr178(辅助)-Tyr129(轴向)配位模式，并通过Lys177形成氢键网络稳定这一结构。相比之下，HtaA^CR1采用更常见的His107(辅助)-Tyr49(轴向)配位模式，其β8-β9环中的Met145靠近铁中心但不参与配位。

血红素结合的光谱学证据

共振拉曼光谱在584-590 cm^-1处观察到Fe-O伸缩振动，证实了酪氨酸-铁配位键的存在。电子顺磁共振谱显示所有CR结构域中的血红素铁均为高自旋五配位状态，排除了Met145参与配位的可能性。

ChtA^CR血红素结合的定量分析

ITC测定野生型ChtA^CR的K_D为22 nM，结合主要由焓驱动(ΔH°=-11 kcal mol^-1)。Y129A突变完全破坏了结合能力，而Y178H突变需与K177G协同才能恢复野生型亲和力，揭示了ChtA^CR独特的辅助残基网络的重要性。

CR结构域的血红素亲和力比较

通过nESI-MS血红素分配实验，研究人员建立了CR结构域亲和力梯度：ChtA^CR(22 nM) < HtaB^CR(5.4 nM) < HtaA^CR1(1.1 nM) ～ HtaA^CR2(850 pM)，这种差异可能指导血红素向细胞内的定向转移。

这项研究首次全面揭示了白喉棒状杆菌血红素载体蛋白的工作机制。与革兰阳性菌中另一类血红素结合蛋白NEAT结构域相比，CR结构域虽然采用完全不同的蛋白质折叠方式，但都通过酪氨酸-铁配位实现相似的血红素亲和力。研究发现的CR结构域间亲和力差异为理解血红素在细菌细胞表面的转移路径提供了新视角。特别值得注意的是，ChtA^CR采用独特的酪氨酸辅助网络，而HtaA^CR1则通过靠近铁中心的甲硫氨酸可能调节血红素的氧化还原性质，这些发现为开发针对细菌铁获取途径的新型抗菌药物提供了重要靶点。该研究不仅增进了对白喉棒状杆菌致病机制的理解，也为其他放线菌病原体的铁获取研究提供了范式。