利用克拉克型氧电极液相测定拟南芥呼吸与光合作用：小组织样本生理研究的新方法

本研究针对传统气体交换和荧光技术难以测量小型拟南芥幼苗光合与呼吸作用的难题，开发了基于Hansatech Oxytherm+P克拉克型氧电极的液相检测系统。通过暗/光交替条件下O2浓度监测，结合KCN、百草枯等抑制剂验证，证实该方法可精准量化线粒体细胞色素氧化酶（COX）呼吸与光系统II（PSII）依赖的光合产氧，并揭示其受生物量、光强及胁迫条件的动态调控。该技术为植物遗传突变体生理研究提供了经济高效的解决方案。

　　

在植物生理学研究领域，拟南芥（Arabidopsis thaliana）作为模式生物虽具有遗传操作优势，但其微小幼苗的生理监测始终存在技术瓶颈。传统红外气体分析仪（IRGA）和脉冲振幅调制荧光仪（PAM）受限于样本体积，难以精准捕捉早期发育阶段的代谢动态。更棘手的是，根系、黄化组织等非光合部位的研究长期缺乏有效工具，这严重阻碍了植物能量代谢网络的整体解析。

来自乌拉圭共和国大学的研究团队在《Plant Science》发表创新成果，将原本用于血液氧监测的克拉克型电极（Clark-type electrode）成功改造为植物微型生理监测平台。该研究通过巧妙的液相环境设计，使完整拟南芥幼苗在毫升级反应体系中实现呼吸与光合作用的同步检测，为突变体库高通量筛选提供了可能。

关键技术包括：1）使用Hansatech Oxytherm+P系统进行O₂浓度实时监测，通过暗/光交替 phases 区分呼吸耗氧与光合产氧；2）采用氰化钾（KCN）抑制线粒体细胞色素c氧化酶（COX），百草枯（paraquat）阻断光系统I（PSI）电子传递等药理学验证；3）建立鲜重标准化模型（20-200 mg范围）；4）结合碳酸氢钠（NaHCO₃）补充实验证实碳固定依赖性；5）开发基于RGB分析的叶绿素绿色指数（GI）与光合活性关联模型。

研究结果揭示：

1. 1.

   代谢活性验证

   通过斜率分析（Eq.1-3）证实O₂通量与生物量呈线性相关（R²>0.9）。KCN处理使暗呼吸降低60%，残留活性可能源于交替氧化酶（AOX）途径；三种光合抑制剂使光依赖产氧抑制率达70-92%，证实PSII依赖性。

2. 2.

   碳固定调控

   1 mM NaHCO₃使光合速率提升6倍，突破液相CO₂扩散限制，证明该方法可反映卡尔文循环完整活性。

3. 3.

   光响应特性

   光强在400 μmol m^-2 s^-1达到饱和，与叶片研究一致，且短暂4500 μmol m^-2 s^-1照射未引发光抑制，显示幼苗强适应性。

4. 4.

   发育与胁迫响应

   黄化幼苗经48小时光照后光合活性显著恢复（GI增加3.5倍）；盐（150 mM NaCl）、渗透（200 mM甘露醇）和氧化（1 M H₂O₂）胁迫分别导致光合下降40%、25%和100%，而呼吸保持稳定，提示光合器对胁迫更敏感。

讨论指出，该方法突破传统技术对样本量的限制，首次实现完整幼苗光合/呼吸的同步检测。其价值体现在：1）可检测黄化过渡等瞬时生理变化；2）温度控制模块（5-40°C）支持代谢热敏感性研究；3）为CRISPR突变体库筛选提供新维度。但需注意液相环境可能改变组织气体交换动力学，且CO₂供应需精确调控以避免成为限制因子。

这项研究不仅为植物生理学提供新工具，其"小型化"设计理念对微生物、藻类等领域亦有启发。未来或可通过耦合红外气体分析（IRGA）实现O₂/CO₂双通道检测，进一步逼近体内真实代谢状态。