CD99介导的免疫突触形成增强CAR-T细胞功能：一种新型CAR设计策略

本研究针对CAR-T细胞疗法在实体瘤中疗效有限的瓶颈问题，通过揭示CD99通过协调微管-肌动蛋白互作促进免疫突触(IS)形成的新机制，开发出整合CD99跨膜-近膜结构域的新型CAR-T细胞(HuTJ-BBz-CAR)。实验证实该设计能显著增强IS稳定性，使CAR-T细胞对淋巴瘤的清除效率提升5倍以上，为优化CAR结构提供了全新思路。论文发表于《Nature Communications》。

　　

在肿瘤免疫治疗领域，CAR-T细胞疗法虽在血液肿瘤中取得突破，但其疗效仍面临两大瓶颈：一是过度激活引发的细胞因子风暴(CRS)，二是实体瘤微环境导致的免疫突触(IS)形成障碍。传统通过增加共刺激分子(如CD28、41BB)结构域来增强CAR-T活性的方法往往加剧毒副作用。研究人员另辟蹊径，将目光投向免疫突触——这个T细胞与靶细胞接触时形成的特殊结构，其成熟度直接影响T细胞的杀伤效能。

研究团队发现膜蛋白CD99是协调IS形成的关键分子。通过构建CD99基因敲除(Cd99^-/-)小鼠模型，首次证实CD99缺失会导致T细胞与抗原呈递细胞(APC)的接合能力丧失。高分辨率显微技术揭示，CD99通过其胞质域结合肌动蛋白、跨膜域锚定微管，像"分子桥梁"般介导细胞骨架重组。当T细胞受体(TCR)被激活时，CD99招募IQGAP1和肌球蛋白IIA(MyoIIA)，形成三元复合物促进微管-肌动蛋白网络互作，这是IS形成不可或缺的力学基础。

基于这一发现，团队创新性地将人源CD99的跨膜-近膜区(TJ结构域)嵌入靶向CD19的CAR结构中，设计出HuTJ-BBz-CAR。体外实验显示，改造后的CAR-T细胞与淋巴瘤细胞(Raji)形成的IS更稳定，表现为：1) 接合效率提高2倍；2) 肌动蛋白极化速度加快；3) 微管组织中心(MTOC)更快定位至突触区。在免疫缺陷小鼠模型中，HuTJ-BBz-CAR-T细胞仅需1/5剂量即可完全清除肿瘤，且扩增峰值提前7天出现。

关键技术包括：1) CRISPR-Cas9构建Cd99^-/-小鼠模型；2) 结构化照明显微镜(SIM)实时观测细胞骨架动态；3) 质谱分析CD99相互作用组；4) 混合淋巴细胞反应(MLR)培养人源效应T细胞；5) 生物发光成像监测小鼠肿瘤负荷。

主要研究结果：

CD99对IS形成和肌动蛋白重组的作用

Cd99^-/- T细胞无法与H60抗原呈递DC形成稳定接合，其肌动蛋白网络呈现异常：lamellipodia(板状伪足)扩展受阻，逆向流动(retrograde flow)消失。Lifeact-mCherry标记显示，野生型(WT)细胞在TCR激活后3分40秒即形成放射状肌动蛋白网络，而突变体细胞仅产生短暂、不规则的聚合。

微管重组与细胞骨架互作机制

SiR-tubulin标记发现Cd99^-/-细胞的垂直微管(pMT)易断裂，无法形成水平微管(hMT)网络。共聚焦显微镜显示WT细胞中微管与肌动蛋白的共定位系数(Manders' coefficient)达0.78，而突变体仅0.32。免疫共沉淀证实CD99通过胞质域结合IQGAP1、跨膜域结合MyoIIA，形成"双锚定"结构维持骨架稳定性。

功能域解析与人类应用转化

通过构建系列突变体证实：1) 胞质域缺失(Cyt-Mut)导致pMT生成减少50%；2) 跨膜域突变(TM-Mut)使微管滞留时间缩短70%。人源T细胞实验显示，仅保留TJ结构域的HuTJ-CD99即可完全恢复IS功能。

新型CAR-T的 therapeutic 效果

在NSG小鼠淋巴瘤模型中，HuTJ-BBz-CAR-T组第7天肿瘤荧光信号即降至背景水平，而传统BBz-CAR组小鼠全部复发。流式检测显示改造组T细胞CD69表达量提升3.2倍，预示更强的激活状态。

这项研究不仅阐明CD99作为"细胞骨架组织者"的分子机制，更开创性地提出IS稳定性优化策略。相比传统共刺激域叠加法，TJ结构域的引入使CAR-T在增强效力的同时避免过度激活风险。该设计原则可推广至其他靶点的CAR构建，为突破实体瘤治疗困境提供新思路。论文最后指出，CD99-IQGAP1-MyoIIA复合物可能普遍存在于需要细胞骨架协同的生理过程(如胞质分裂)，这为理解更多免疫学现象提供了理论框架。