DeFrND技术：基于工程化膜支架肽的无去污剂纳米盘重构新策略实现膜蛋白天然脂质环境研究

本研究针对传统纳米盘(ND)技术依赖去污剂导致膜蛋白结构与功能受损的瓶颈问题，开发了新型膜支架肽(DeFrMSPs)介导的无去污剂纳米盘(DeFrNDs)重构技术。通过系统优化载脂蛋白A1模拟肽(18A)的脂肪酸修饰，成功实现从天然膜直接提取MalFGK2转运体、mGluR7受体等膜蛋白复合物，并保持其天然脂质环境与功能活性。该技术突破性地解决了去污剂敏感型膜蛋白的研究难题，为膜蛋白结构与功能研究提供了更接近生理状态的新工具，相关成果发表于《Nature Communications》。

　　

在生命科学领域，膜蛋白研究长期面临一个根本性矛盾：要研究这些嵌入脂质双层的蛋白质，必须先用去污剂将它们"拽"出来，但这个过程往往会破坏其天然结构和功能。就像试图研究鱼缸里的鱼却不得不把水抽干一样，传统方法使科学家们陷入两难境地。这种困境在ABC转运体、GPCR等重要膜蛋白研究中尤为突出，因为这些蛋白质的构象变化和功能活性高度依赖周围的脂质环境。

传统纳米盘技术虽然部分解决了这个问题，但其构建过程仍需去污剂参与，且难以保持天然膜的不对称性。更棘手的是，许多膜蛋白复合物在去污剂中会解聚或失活，使得后续研究举步维艰。聚合物纳米盘虽能绕过去污剂，但对二价离子敏感且脂质交换过快，这些问题都限制了其在膜生物学研究中的应用广度。

为突破这些限制，Qian Ren等研究人员在《Nature Communications》发表的研究中，开创性地开发了基于工程化膜支架肽的无去污剂纳米盘(DeFrNDs)技术。这项研究从改造天然抗菌肽和载脂蛋白A1模拟肽入手，通过系统优化设计出一类能直接穿透细胞膜并稳定包裹膜蛋白的新型肽支架，成功实现了在完全避免去污剂的情况下，将膜蛋白连同其天然脂质环境一起"打包"成可溶性纳米盘。

关键技术方法包括：1)通过理性设计和筛选构建膜支架肽(DeFrMSPs)库；2)采用脂肪酸修饰增强肽的膜穿透能力；3)利用蓝色天然电泳和尺寸排阻色谱(SEC)评估纳米盘形成效率；4)结合冷冻电镜(cryo-EM)解析膜蛋白三维结构；5)开发单分子荧光成像分析HCN1通道功能；6)建立膜融合和脂质不对称性检测体系。研究使用了大肠杆菌和HEK293细胞来源的膜蛋白样本。

【筛选膜支架肽实现无去污剂ND重构】

研究人员首先以细菌ABC转运体MalFGK2为模型，测试了18A等12种两亲性肽的膜蛋白提取能力。结果显示，载脂蛋白A1模拟肽能成功将MalFGK2从蛋白脂质体转化为纳米盘，但存在多聚体混杂问题。其中18A效果最佳，形成的纳米盘虽不均一，但MalFGK2的ATP酶活性保持完好，证明其功能未受破坏。

【脂肪酸修饰增强DeFrMSPs效能】

通过N端己酸(Hex)修饰18A，研究人员显著提高了纳米盘的均一性。Hex18A形成的MalFGK2纳米盘直径约12nm，外层包裹2.5nm厚的PC脂质层。冷冻电镜分析显示，这些纳米盘质量足以解析3.3?分辨率的MalFGK2闭合态结构，与晶体结构高度一致。

【DeFrNDs封装稳定功能性膜结构】

研究发现DeFrNDs能稳定包裹10-50nm的脂质双分子层，其脂质堆积特性与最新电中性聚合物相当。通过FRET实验证实，与聚合物纳米盘不同，DeFrNDs中的脂质不会快速交换。更重要的是，DeFrNDs成功保留了突触结合蛋白(syt1)与阴离子脂质的Ca²⁺依赖性相互作用，以及SecA与PG脂质的特异性结合。

【细菌膜蛋白复合物的DeFrNDs重构】

优化后的Hex20B1WA肽能直接从大肠杆菌膜中提取MalFGK2，效率比Hex18A提高2.5倍。冷冻电镜在ATP水解条件下首次捕捉到MalFGK2的内向与外向构象共存状态。尤为重要的是，该技术成功稳定了在去污剂