Pore-C Pipeline-Toolbox：基于纳米孔长读长测序的多维染色质互作分析新工具

本研究针对三维基因组学中多维染色质互作（multi-way chromatin interactions）分析的瓶颈问题，开发了Pore-C Pipeline-Toolbox（PPL-Toolbox）。该工具整合了纳米孔长读长测序与染色体构象捕获（3C）技术，通过超图降噪、单倍型注释等创新模块，显著提升了多维互作数据的提取精度和信噪比。研究证实其可解析增强子-启动子网络等复杂空间结构，为三维基因组研究提供了标准化分析方案。

　　

三维基因组研究的"多维革命"

在真核细胞中，染色质并非随机分布，而是通过复杂的空间折叠形成三维（3D）架构，这种结构对基因调控至关重要。传统技术如Hi-C（染色体构象捕获）虽能捕获染色质"两点"互作，却难以解析增强子集群、启动子多路复用等涉及多个位点的"多维对话"。这种局限性严重制约了人们对基因协同调控机制的理解。

2019年，整合纳米孔长读长测序与3C技术的Pore-C横空出世，它能一次性捕获全基因组范围内多个染色质位点的共定位信息。然而，这项突破性技术却面临分析工具匮乏的窘境——现有流程如Pore-C Snakemake存在功能单一、标准化不足等缺陷，特别是对高频出现的跨染色体"噪声互作"（trans VPCs）缺乏有效过滤手段。

工具箱的诞生

华中农业大学李国亮团队开发的PPL-Toolbox，如同为多维基因组研究量身定制的"瑞士军刀"。该工具创新性地引入超图理论，将每个Pore-C串联体视为超边（hyperedges），通过团扩展算法（Clique Expansion Algorithm）将低频率互作判定为噪声并过滤。测试显示，经处理后数据中跨染色体互作比例显著降低，与经典Hi-C数据特征更趋一致。

关键技术突破

研究团队采用多模块协同策略：

1. 1.

   基于minimap2的优化比对流程，通过Dijkstra算法筛选最小惩罚值的片段组合

2. 2.

   独创DVD（Difference value of distances）指标定量评估纳米孔堵塞效应

3. 3.

   MultiHaploTag方法利用GIAB联盟的SNP数据构建单倍型分辨互作图谱

4. 4.

   MultiVis可视化模块整合k-means聚类与UMAP降维，可呈现PAX5等基因的增强子网络

多维互作的精密解析

噪声过滤的革命性进展

在GM12878细胞系测试中，PPL-Toolbox将虚拟成对接触（VPCs）从9.02亿降至7.92亿，同时有效保留真实的多维互作（从477万增至500万）。热图对比显示，处理后数据中拓扑关联结构域（TAD）边界更为清晰。

单倍型不平衡的发现

通过分析60万个含杂合SNP的片段，工具成功捕捉到X染色体失活导致的单倍型失衡现象。在500Kb分辨率下，失活的父源X染色体呈现典型的两大超结构域（super-domain），而活跃的母源X染色体则无此特征。

可视化增强

以B细胞关键转录因子PAX5为例，MultiVis模块清晰展示其核心增强子E14所在的微域（micro-domain）存在多向互作热点，暗示这些区域可能是基因调控的网络枢纽。

开启三维基因组新纪元

PPL-Toolbox的诞生标志着多维染色质研究进入标准化时代。其创新性体现在：

1. 1.

   首次建立Pore-C数据质量评估体系，通过BOTH/CLOSER距离量化测序偏差

2. 2.

   突破性地实现20.7%片段的单倍型标记，远超Hi-C技术的分型能力

3. 3.

   兼容scNanoHi-C等单细胞多维数据，为研究细胞异质性提供新可能

研究团队在讨论中指出，当前工具对稀疏矩阵的聚类性能仍有提升空间。未来整合深度学习算法，或将揭示更多隐藏的多维染色质调控密码。该成果发表于《Briefings in Bioinformatics》，为三维基因组学研究提供了不可或缺的分析利器。