综述：合成生物学启发的减毒活流感疫苗开发

这篇综述系统总结了减毒活流感疫苗(LAIV)的最新研发策略，重点介绍了基于合成生物学的理性设计方法，包括NS1蛋白截短、M2缺陷病毒、基因组重排、HA切割位点修饰、microRNA介导的减毒、密码子/密码子对去优化、遗传密码扩展、转座子诱变、干扰素敏感病毒和小分子调控等9大技术路径，为开发更安全高效的下一代流感疫苗提供了系统解决方案。

　　

流感病毒的威胁与疫苗现状

流感病毒作为呼吸道传染病的主要病原体，每年导致全球约10亿感染病例和29-65万死亡。根据核蛋白抗原性可分为A、B、C、D四型，其中A型(IAV)和B型(IBV)是引发季节性流感的主要病原。IAV的基因组由8个RNA节段组成，编码包括血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)和基质蛋白(M2)等12种蛋白。

当前流感疫苗主要包括灭活疫苗(IIV)和减毒活疫苗(LAIV)两类。传统LAIV如FluMist通过冷适应传代获得减毒特性，但存在效力不稳定、适用人群有限(2-49岁健康人群)等问题。流感病毒通过抗原漂移和抗原转换持续变异，导致疫苗保护率常低于60%，亟需开发新型疫苗平台。

理性设计的减毒策略

NS1缺陷/截短流感病毒

NS1是流感病毒的关键毒力因子，能抑制宿主I型干扰素(IFN)应答。通过反向遗传学技术构建NS1缺失(ΔNS1)或C端截短(如NS1 1-126)的病毒株，可在干扰素缺陷型细胞中高效增殖，而在正常宿主中显著减毒。

研究表明，单剂NS1 1-99截短的H5N1疫苗可完全保护小鼠抵抗致死剂量攻击。目前三价ΔNS1疫苗已完成I/II期临床试验，显示良好安全性和免疫原性。

M2缺陷流感病毒

M2蛋白的胞质尾区对病毒组装至关重要。通过引入终止密码子删除M2胞质尾区11个氨基酸(M2del11)或完全敲除M2基因(M2KO)，可获得复制受限的疫苗候选株。

特别值得关注的是M2单次复制病毒(M2SR)，其只能在表达M2的互补细胞系中增殖。临床研究显示M2SR能诱导持久的黏膜和血清抗体反应，目前已扩展应用于B型流感病毒(BM2缺陷株)的疫苗开发。

病毒基因组重排

通过改变病毒基因节段的天然排列或插入外源基因，可构建多价疫苗载体。典型策略包括：

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  PB2基因替换为GFP的复制缺陷型病毒

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  在H9N2骨架中插入H5 HA基因的双价疫苗

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  表达额外HA节段的九节段重组病毒

这类设计不仅能实现减毒，还可表达保守抗原表位，增强交叉保护。例如表达H1和H3双HA的疫苗能同时预防两种流行株感染。

其他创新技术

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  HA切割位点修饰：将HA切割位点从胰蛋白酶依赖型改造为弹性蛋白酶依赖型(WSN-E突变体)，限制病毒在常规宿主中的复制能力

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  microRNA介导减毒：在NP基因插入miR-93识别元件，利用组织特异性miRNA实现选择性减毒

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  密码子去优化：使用宿主非偏好性密码子降低病毒蛋白翻译效率，如NS基因去优化株能在保持抗原性的同时实现稳定减毒

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  遗传密码扩展：引入非天然氨基酸依赖的终止密码子(PTC-4A)，使病毒复制严格依赖转基因生产系统

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  蛋白降解靶向(PROTAR)：在M1蛋白C端添加蛋白酶体靶向降解标签(PTD)，通过宿主泛素-蛋白酶体系统调控病毒蛋白稳定性

未来展望

合成生物学驱动的理性设计正在重塑LAIV开发范式。与传统经验方法相比，这些技术具有三大优势：

1. 1.

   安全性：通过多重遗传屏障降低毒力回复风险

2. 2.

   广谱性：可靶向保守表位或设计多价疫苗

3. 3.

   快速响应：细胞培养平台结合基因合成技术可加速疫苗生产

下一代LAIV仍需解决大规模生产工艺优化、特殊人群适用性评估等挑战。随着类器官芯片等新型评价体系的发展，这些创新疫苗有望为流感防控提供更强大的武器。