基于胶原塑形技术构建人源真皮-表皮皮肤替代物中网状脊结构的简易方法及其稳定性研究

本研究针对皮肤替代物中真皮-表皮连接处(DEJ)缺乏网状脊(RR)结构的关键问题，通过改良压缩活塞模具技术，在纯I型胶原水凝胶中成功构建了仿生RR结构。结果表明该方法操作简便、避免毒性交联剂，但RR尺寸稳定性和DEJ结构完整性仍需优化，为提升皮肤移植物的机械性能和营养交换提供了新策略。

　　

皮肤作为人体最大的器官，其复杂的微观结构一直是组织工程领域的重点难题。其中，真皮-表皮连接处(DEJ)的波浪状结构——网状脊(Rete ridges, RR)和真皮乳头(Dermal papillae, DP)对皮肤机械强度和营养交换至关重要。然而，现有真皮-表皮皮肤替代物(Dermo-epidermal skin substitutes, DESS)普遍缺乏这种三维结构，导致移植后易发生分层、机械性能不足等问题。尤其对于大面积烧伤、先天性巨痣等患者，功能性皮肤重建的需求尤为迫切。

苏黎世大学儿童医院的研究团队在《Experimental Cell Research》发表的研究中，创新性地通过改良实验室原有胶原塑形技术，开发了一种无需复杂设备或毒性交联剂的RR构建方案。研究采用人包皮来源的角质形成细胞(KC)和成纤维细胞(FB)，通过电火花加工制备具有特定尺寸(200×200μm或400×400μm)的铝制活塞模具，在I型胶原水凝胶凝胶化和塑料压缩过程中同步完成RR结构的塑造。通过21天的体外培养体系，结合Sirius Red染色、免疫荧光等技术系统评估了RR结构的时空变化规律。

关键技术方法

研究团队采用三步核心技术：(1)电火花加工制备带RR纹理的铝制压缩活塞；(2)将FB混入I型胶原溶液后注入活塞模具，经凝胶化和塑料压缩形成1mm厚仿生真皮层；(3)在第7天接种KC，通过气-液界面培养促进表皮分化。实验使用人包皮样本(经伦理批准)分离原代细胞，通过系列组织学染色和Ki67等标志物分析表皮分化状态。

研究结果

3.1 细胞增殖与胶原重塑动态

活细胞染色显示FB均匀分布于水凝胶，接种KC后逐渐填充RR凹陷。但到第21天气-液界面培养时，表皮层增厚导致RR宏观形貌消失，提示KC介导的胶原重塑影响了结构维持。

3.2 RR结构的时空演变

Sirius Red染色揭示：400×200μm组在第2天即可见完整RR，但DP区域胶原密度显著低于基体。第10天KC接种后RR深度减少50%，第21天出现表皮内陷(蓝色箭头)与真皮包涵体(白色箭头)，反映DP侧向弯曲导致的截面异质性。

3.3 模具尺寸效应

200×200μm组在初期能保持设计尺寸，但第14天后RR宽度缩减至60%；400×400μm组则表现出更好的结构维持性，提示更大尺寸可能抵抗KC介导的收缩。

3.4 表皮分化状态

免疫组化显示：层粘连蛋白332(Lam332)和XVII型胶原(Col17A1)在基底层呈点状分布，未形成连续基底膜；角蛋白19(K19)全层散在分布，与天然皮肤基底部富集模式不同，证实表皮尚未完全稳态化。

结论与展望

该研究通过"模具塑形-塑料压缩"的简易策略，首次在无交联剂的纯胶原体系中实现了RR构建。虽然RR尺寸稳定性和DEJ完整性仍需优化，但避免了EDC等有毒交联剂的使用，具有更好的临床转化潜力。值得注意的是，移植后微环境可能促进RR成熟——团队前期研究显示DESS移植7周后才形成完整基底膜。未来可通过酶交联、动态培养等技术进一步提升结构稳定性，或结合3D打印实现RR尺寸精确调控。这项技术突破为改善皮肤移植物机械性能和营养交换效率提供了新思路，对烧伤、遗传性大疱性表皮松解症等需大面积皮肤重建的疾病具有重要价值。