COMBO三联检测：基于AmpliSeq技术的常染色体与单亲系谱（Y染色体及线粒体DNA）生物地理祖源与外貌特征分析新策略

为解决法医DNA表型分析中多重标记整合难题，研究人员开发了基于AmpliSeq技术的COMBO三联检测体系，整合VISAGE ET/BT、HID Y-SNP和PID mtDNA三组标记，实现单次测序同时分析524/153个外貌与祖源SNP、781个Y-SNP及162个线粒体扩增子。该研究通过Ion GeneStudio S5系统验证，在灵敏度、降解样本和真实案例中表现优异，显著提升DNA利用率并降低检测成本，为法医遗传学提供多维度生物特征解析工具。

　　

在法医调查中，DNA表型预测(FDP)已成为缩小潜在嫌疑人范围的重要技术。然而随着遗传标记数量的增加，传统方法面临多重挑战：不同基因组区域（常染色体、Y染色体和线粒体DNA）的标记需分别检测，导致珍贵样本的DNA被重复消耗；线粒体DNA(mtDNA)与核DNA(nDNA)拷贝数差异使得整合分析困难；现有技术难以在单次检测中实现千级扩增子的高效覆盖。这些问题严重制约了法医DNA分析的效率和成本效益。

为突破这些技术瓶颈，奥地利因斯布鲁克医科大学法医学研究所的Christina Amory、Robert Lagacé、Walther Parson和Catarina Xavier团队在《Forensic Science International: Genetics》发表了创新性研究。他们开发了COMBO三联检测体系，首次将外貌与祖源预测的VISAGE Enhanced/Basic Tool(ET/BT)、781个Y-SNP组成的HID Y panel以及覆盖全基因组的162个mtDNA扩增子(PID mtDNA)整合至单次AmpliSeq反应中。

研究采用Ion GeneStudio S5测序系统，通过四阶段技术路线实现目标：首先优化引物浓度组合（Test A-D），比较VISAGE ET与BT的性能差异；随后进行内部验证，包括灵敏度测试（0.016-1 ng DNA梯度）、降解样本分析（150-200年历史骨骼）和真实案例应用；采用SD Quants定量技术校正样本DNA含量；数据分析整合HID SNP Genotyper、Yleaf、EMPOP等生物信息学工具，通过SNIPPER和STRUCTURE进行祖源成分解析，HIrisPlex-S系统预测外貌特征。

研究结果展现出三大突破性发现：在技术开发部分，COMBO 02（VIS BT+HID Y+PID mtDNA）表现最优，核SNP平均检出率达99.25%，线粒体基因组覆盖完整。引物比例调整为5:5:1（VIS BT:HID Y:PID mtDNA）时，成功平衡不同基因组区域的扩增效率。灵敏度测试显示，即使16 pg输入DNA仍能检测58%核SNP，远超同类技术。

在应用验证中，该技术展现出强大适应性：27例挑战性样本（含二战骨骼）分析显示，80年历史样本mtDNA覆盖度达99.7%，核SNP检出率95.9%。特别值得注意的是，通过调整mtDNA引物浓度（降至1/10），成功解决了骨骼样本中mtDNA过表达导致的核DNA信息丢失问题。在11例模拟案件样本中，系统准确识别出欧洲-南亚混血个体（如G40S2样本含29.2%东亚成分），其Y单倍群J-ZS4416和mtDNA单倍群V1a1的协同分析为祖源解析提供了多维证据。

历史样本分析凸显技术优势：200年前的指骨样本（HS1）虽仅获54.9%核SNP，但结合线粒体单倍群K1a与Y单倍群RZ9，仍准确推断出欧洲祖源。两个真实案例（CASE 01/02）通过保守分析与替代分析策略，在部分基因型缺失情况下保持预测稳定性，皮肤颜色预测AUC（曲线下面积）损失仅0.006。

该研究的创新价值体现在三个方面：技术上首次实现三基因组标记的AmpliSeq整合，单次反应覆盖1,468个遗传标记；方法学上建立降解样本的引物动态调整策略，将mtDNA/nDNA比例纳入实验设计参数；应用层面提供"常染色体-父系-母系"三位一体的祖源解析方案，结合HIrisPlex-S外貌预测，构建了迄今最全面的法医DNA智能分析体系。

正如作者指出，COMBO技术将常规需三次独立检测的内容压缩至单次运行，不仅节省60%以上成本，更显著减少珍贵样本消耗。这对于微量DNA案件、历史遗骸鉴定等场景具有革命性意义。未来通过引入更多表型标记和祖先信息SNP，该技术框架有望进一步拓展，成为法医遗传学领域的标准化分析平台。研究团队特别强调，该技术的核心价值在于将实验室从重复性工作中解放出来，使法医专家能更专注于数据解读与案件推理，最终提升司法正义的实现效率。