综述：复杂肿瘤微环境中DNA甲基化异质性的定量方法、影响因素及临床意义

这篇综述系统阐述了肿瘤微环境(TME)中DNA甲基化异质性(DNAmeH)的特征，详细介绍了包括PDR、MHL、PIM等定量方法，分析了细胞周期、TMB、CNV等内源性因素及缺氧、肿瘤纯度等外源性因素的影响，并探讨了ctDNA甲基化标志物在癌症早期检测和个性化治疗中的临床应用前景。

　　

复杂肿瘤微环境中的DNA甲基化异质性

细胞表型可塑性

DNA甲基化(5mC)异常是肿瘤发生发展的关键因素，表现为原癌基因调控区低甲基化和抑癌基因高甲基化。TP53启动子高甲基化可加速肝癌进展，而MYC增强子低甲基化会激活侵袭性肿瘤细胞。重复序列如LINE-1低甲基化与结直肠癌染色体不稳定性相关，而CpG岛高甲基化通过招募MeCP2和HDACs导致染色质压缩。CD8⁺ T细胞中DNMT3a调控记忆前体细胞分化，CAFs的TGF-β通路甲基化改变则影响其促肿瘤活性。

DNA甲基化异质性特征

单细胞水平甲基化呈二元分布(0/1)，但组织样本因细胞混合常呈现中间值。检测技术包括：

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  全基因组：WGBS、MeDIP-seq

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  位点特异性：RRBS、850K甲基化芯片

  表观等位基因(epiallele)多样性反映细胞异质性，如16种四联CpG组合的epipolymorphism值最高达0.9375。半甲基化(如卵巢癌Sat2序列)具有链特异性，可作为肿瘤进展监测指标。

定量方法

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  PDR：连续CpG位点不一致读段比例，反映克隆进化

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  MHL：甲基化单倍型负荷，量化完全甲基化CpG比例

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  qFDRP：基于汉明距离的读对不一致定量

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  PIM：中间甲基化位点比例，与TME细胞组成相关

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  MIRA：整合基因组注释量化调控区域活性

影响因素

内源性因素

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  细胞周期：S期DNA复制错误导致甲基化紊乱，G1期CDKN2A高甲基化促进进展

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  基因组变异：73%癌种中高CNV区域DNAmeH显著增加(P<0.05)

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  TMB：与inter-tumor DNAmeH强相关(R=0.67)，胶质瘤中高TMB预示不良预后

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  干性特征：79%癌种高干性样本呈现低DNAmeH

外源性因素

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  缺氧：通过抑制TET酶活性增加DNAmeH，85%癌种缺氧样本异质性升高

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  肿瘤纯度：与DNAmeH呈负相关(R=-0.73)，94%癌种低纯度样本异质性更显著

临床转化

甲基化标志物在NSCLC抗PD-1治疗中预测效果优于PD-L1表达，乳腺癌放疗后免疫通路CpG位点甲基化显著改变。ctDNA甲基化动态监测可预测CRC肝转移患者化疗敏感性。MethylCIBERSORT等算法通过甲基化谱解析TME细胞组成，而EPIC芯片检测的cg07610777(GJB6)等位点已成为HCC早期诊断标志物。

挑战与展望

当前单细胞甲基化测序覆盖度不足限制DNAmeH精确量化，需开发靶向热点区域测序策略。整合多组学数据将深化对肿瘤进化机制的理解，而基于甲基化异质性的分型有望推动个性化治疗策略优化。